【摘要】：研究背景與目的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是肝癌發(fā)生的一個獨立危險因素,隨著肥胖和糖尿病的逐年增多,其發(fā)生率也是成指數(shù)級上升。肝臟脂肪代謝異常、脂代謝相關基因的失調控與NAFLD、非酒精性脂肪肝炎(NASH)及肝癌的發(fā)生密切相關�，F(xiàn)已證明,Ras通路的激活已普遍存在于人類肝細胞癌中,然而,Ras通路的激活與肝癌中肝臟脂代謝異常之間的關系并不十分清楚。遂本課題旨在研究癌基因Kras對肝臟脂代謝的影響,探討它對脂代謝的調控與肝癌發(fā)生的關系及NAFLD向肝癌轉化過程中的作用。為尋找肝病患者的早期干預靶標提供理論基礎。實驗方法及步驟1.野生型小鼠非酒精性脂肪性肝病模型的建立將野生型小鼠(wild type)在成年后,喂養(yǎng)60%的高脂飲食建立NAFLD模型。檢測其肝臟組織Ras下游通路的表達水平。2.Kras突變轉基因小鼠的繁殖與鑒定Kras~(G12D)嵌合lox P系統(tǒng)小鼠由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院八所楊曉主任實驗室引入,而白蛋白(Alb)啟動子嵌合Cre小鼠(Alb-cre)由南京模型動物中心購置。將引入的Found鼠與Alb-Cre小鼠飼養(yǎng)交配,利用Cre-lox P系統(tǒng)的臟器特異性敲入靶基因功能制造Kras肝臟特異性突變小鼠(Kras~(G12D)),用于后續(xù)的實驗研究。3.轉基因小鼠的單純飲食肥胖模型選定肝臟特異性Kras~(G12D)突變鼠以及同窩對照小鼠,在其出生后8周時進行高脂飲食或對照飲食的喂養(yǎng)。每周固定時間稱量一次體重,并確保食物均是過量給予,連續(xù)喂養(yǎng)16周或20周后取材,檢測脂肪肝及肝癌相關指標。小鼠血清ALT和AST水平測定檢測肝功情況;小鼠HE染色,檢測肝臟的組織結構、脂肪變性及癌變程度;體重、肝重、外周脂肪標志肥胖模型的整體情況;肝臟組織甘油三酯及總膽固醇含量的分析,檢測肝臟內脂肪的累積情況;肝組織游離脂肪酸含量檢測肝臟內脂肪的成分;葡萄糖耐量實驗,反應活體下的胰島素抵抗情況;ki67染色檢測肝細胞的增殖情況;Epcam?CD44,CD105,CD90分子的染色檢測肝臟中腫瘤起始細胞的表達情況;收集肝組織RNA,利用RT-PCR,檢測炎癥因子以及巨噬細胞的侵潤情況;Western blot檢測Ras相關通路的活化。4.高脂飲食聯(lián)合二乙基亞硝胺的快速誘癌模型將肝臟特異性Kras~(G12D)突變鼠出生第15天時,按照25mg/kg的劑量腹腔注射DEN。并于8周齡時進行高脂飲食或對照飲食的喂養(yǎng)。每周固定時間稱量一次體重,并確保食物均是過量給予,連續(xù)喂養(yǎng)10周或17周后取材,觀察各組之間的成瘤情況。5.機制探詢(1)小鼠代謝籠檢測Kras~(G12D)突變鼠與野生型小鼠,在新陳代謝等整體機能水平上的差異(2)Western blot、RT-PCR、免疫組化檢測各組小鼠肝臟組織中,脂肪酸合成以及脂肪酸β氧化相關分子的表達情況(3)組織試劑盒檢測各組小鼠肝臟的活性氧簇,總谷胱甘肽以及氧化性谷胱甘肽的含量。(4)Western blot檢測各組小鼠肝臟組織中DNA損傷修復以及細胞凋亡分子的表達情況(5)免疫組化輔證小鼠肝臟組織中DNA損傷與修復情況(6)體內注射CPT1A抑制劑(etomoxir),觀察抑制腫瘤的效果實驗結果野生型小鼠NAFLD形成過程中,肝臟組織中Ras下游通路活化;而且,肝內特異性過表達Kras的小鼠在NAFLD形成過程中,其下游通路進一步被激活;因此本研究旨在探索Kras在非酒精性脂肪性肝病及其向肝癌惡性轉化中的作用機制。我們通過培育肝臟特異性Kras~(G12D)突變型小鼠,在其出生后6-8周齡時喂養(yǎng)高脂飲食飼料(HFD)以及正常對照飼料(ND)。與對照相比,我們發(fā)現(xiàn)高脂飲食下的Kras~(G12D)小鼠最早出現(xiàn)肝細胞癌,肝臟腫瘤數(shù)目以及最大直徑顯著增多;肝細胞增殖以及腫瘤起始細胞表面標志物表達顯著升高;此外,在高脂飲食下,Kras~(G12D)小鼠體重明顯輕于對照(WT)小鼠。我們檢測了脂肪肝相關系列指標,發(fā)現(xiàn)與對照小鼠相比,Kras~(G12D)小鼠的肝重,肝內甘油三酯及游離脂肪酸水平均較低,提示在Kras~(G12D)小鼠中高脂飲食引起的脂肪肝效應較輕。我們進一步利用體重未出現(xiàn)差異之前的兩組小鼠進行探究,發(fā)現(xiàn)Kras~(G12D)小鼠的基礎代謝率較高,且脂肪酸從頭合成途徑中的關鍵分子(如:ACC1,SCD1等)表達較低,在轉錄水平,促進脂肪酸氧化的相關基因(CPT1A,PPARα,ATGL,AOX等)均在高脂Kras~(G12D)小鼠中顯著上調,在蛋白水平,脂肪酸β氧化的關鍵限速酶(CPT1A)上調明確,推測可能是因為Kras~(G12D)肝內具有過度的脂肪酸氧化效應導致肝內的脂肪堆積減少,與此同時,Kras~(G12D)小鼠在高脂飲食喂養(yǎng)下,其肝內出現(xiàn)了明顯的氧化應激,即肝內總ROS,以及GSSG上升,GSH下降,γ-H2AX,P53BP1,MDA相關氧化損傷應答指標表達上調,凋亡相關信號通路也表達增高。推測可能是由于肝內過度脂肪酸氧化導致了氧化應激加重,從而在后期促進了腫瘤形成,故我們使用了CPT1A的抑制劑etomoxir,在給予腹腔注射5周后,發(fā)現(xiàn)其有明顯抑制腫瘤的效果。至此本研究提示Kras可通過促進肝內脂肪酸的β氧化減輕HFD誘導的NAFLD形成,但加重氧化應激,進而促進了肝細胞癌的發(fā)生;并提示CPT1A可作為肝癌治療中的一個潛在干預靶點。結論在高脂飲食環(huán)境下,Kras可通過抑制脂肪酸的合成以及促進脂肪酸的β氧化從而減輕高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝,但促進肝細胞增殖及肝癌干細胞標志物表達,加重氧化應激及DNA損傷,加速肝癌的發(fā)生發(fā)展。本文闡述了Ras對肝臟脂質代謝的調控及其對肝癌發(fā)生的影響,為尋找肝病患者的早期干預靶標提供了理論基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R575.5;R735.7

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本文編號：2297358