發(fā)布時間：2018-10-29 10:23

【摘要】：胃癌是最常見的消化系腫瘤,在我國其發(fā)病率位于惡性腫瘤的第2位,死亡率位于第3位,其中胃腺癌又占胃惡性腫瘤的90%以上。研究已證實白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)與胃腺癌的發(fā)生與發(fā)展相關(guān),但迄今為止其分子機(jī)制尚未完全清楚。原癌基因Src的表達(dá)產(chǎn)物c-Src蛋白激酶是最早發(fā)現(xiàn)的Src家族激酶(SFKs)成員,先前的研究發(fā)現(xiàn)IL-1β可激活肺腺癌細(xì)胞中的c-Src,從而增加細(xì)胞的遷移;IL-1β和c-Src均能增加胃腺癌細(xì)胞的存活,然而L-1β是否也能激活胃腺癌細(xì)胞中的c-Src,從而引起胃腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變及其機(jī)制到目前為止尚未見相關(guān)的報道,因此,本課題選擇對其進(jìn)行初步的探究。在本研究中,我們選擇胃腺癌MKN-45細(xì)胞作為研究對象,目的是為了初步闡明IL-1β在MKN-45細(xì)胞中是否能激活c-Src,探究IL-1β激活c-Src后對胃腺癌細(xì)胞存活的影響,并初步探究其機(jī)制是否涉及到STAT3,旨在為尋找胃腺癌患者治療的新方法奠定良好的實驗基礎(chǔ)。研究分為三個部分進(jìn)行。第一部分研究的內(nèi)容是“IL-1β通過c-Src蛋白激酶增加胃腺癌細(xì)胞存活作用的初步研究”,技術(shù)路線方法包括:1.Annexin V+PI染色,流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡檢測IL-1β刺激對MKN-45細(xì)胞存活的影響,并利用IL-1β中和抗體預(yù)處理細(xì)胞,檢測其預(yù)處理后對IL-1β增加MKN-45細(xì)胞的存活是否存在抑制作用。2.Western-blot法測定MKN-45細(xì)胞接受IL-1β刺激后,磷酸化c-Src蛋白的表達(dá)以及IL-1β中和抗體和c-Src特異性抑制劑PP1對IL-1β誘導(dǎo)的c-Src激活的抑制作用。3.應(yīng)用c-Src特異性抑制劑PP1結(jié)合Annexin V+PI染色后流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡,檢測PP1預(yù)處理后對IL-1β增加MKN-45細(xì)胞的存活是否存在抑制作用。第二部分研究的內(nèi)容是“c-Src低表達(dá)細(xì)胞株的獲得以及抑制c-Src的表達(dá)對IL-1β促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞存活作用的影響”,技術(shù)路線方法包括:1.建立針對c-Src基因兩個不同靶位的c-Src sh RNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的c-Src低表達(dá)的MKN-45細(xì)胞株。2.Annexin V+PI染色后流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡實驗檢測c-Src表達(dá)沉默后對IL-1β增加MKN-45細(xì)胞存活是否存在抑制作用。第三部分研究的內(nèi)容是“初步探究IL-1β激活c-Src蛋白激酶增加胃腺癌細(xì)胞存活的機(jī)制”,技術(shù)路線方法包括:1.應(yīng)用免疫共沉淀試驗初步探討IL-1β激活c-Src是否通過誘導(dǎo)TRAF6與c-Src相互作用從而激活c-Src;2.western-blot檢測分別應(yīng)用c-Src及Stat3特異性抑制劑PP1及WP1066預(yù)處理前后,以及轉(zhuǎn)染c-Src sh RNA抑制c-Src的表達(dá)后,對IL-1β增加MKN-45細(xì)胞中磷酸化Stat3表達(dá)的影響。3.應(yīng)用Stat3抑制劑WP1066進(jìn)一步檢測IL-1β增加胃腺癌細(xì)胞存活的機(jī)制是否涉及Stat3。第一部分結(jié)果:1.IL-1β刺激后可減少血清饑餓誘導(dǎo)的MKN-45細(xì)胞的凋亡細(xì)胞凋亡測定結(jié)果顯示:無血清培養(yǎng)的MKN-45細(xì)胞接受IL-1β刺激后,其凋亡數(shù)顯著降低,與未接受IL-1β刺激的對照細(xì)胞比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義p0.05;用IL-1β中和抗體預(yù)處理細(xì)胞后,此作用則被抑制,表明IL-1β能夠增加胃腺癌MKN-45細(xì)胞的存活。2.IL-1β的刺激可激活胃腺癌細(xì)胞MKN-45的c-Src蛋白激酶Western blot結(jié)果顯示:IL-1β刺激后,能激活胃腺癌MKN-45細(xì)胞的c-Src,可檢測到磷酸化的c-Src表達(dá)上調(diào),此作用可被IL-1β中和抗體和c-Src特異性的抑制劑PP1所抑制,表明IL-1β能夠激活c-Src。3.IL-1β促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞MKN-45的存活作用可被c-Src特異性抑制劑PP1所抑制,表明IL-1β增加胃腺癌細(xì)胞存活的作用可能是通過激活c-Src蛋白激酶。第二部分結(jié)果:1.成功地獲得了c-Src低表達(dá)的MKN-45細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p GPU6/GFP/Neo-c-SRC sh RNA1和p GPU6/GFP/Neo-c-SRC sh RNA2以及si RNA陰性對照(p GPU6/GFP/Neo-Scramble sh RNA)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。2.敲減c-Src的表達(dá)后,明顯減弱IL-1β促進(jìn)MKN-45細(xì)胞存活的能力,進(jìn)一步表明IL-1β增加胃腺癌細(xì)胞存活的作用是通過激活c-Src蛋白激酶。第三部分結(jié)果:1.免疫共沉淀結(jié)果初步表明:IL-1β激活c-Src是通過誘導(dǎo)TRAF6與c-Src形成復(fù)合物而實現(xiàn)的。2.IL-1β激活c-Src蛋白激酶后通過激活其下游信號分子Stat3增加胃腺癌細(xì)胞存活。Western blot測定結(jié)果表明,接受IL-1β刺激后,MKN-45細(xì)胞中的磷酸化的Stat3表達(dá)增加,此作用可分別被c-Src和Stat3的特異性抑制劑PP1和WP1066以及轉(zhuǎn)染c-Src sh RNA抑制了c-Src的表達(dá)所抑制。3.Annexin V+PI染色后流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:用Stat3抑制劑WP1066預(yù)處理的MKN-45細(xì)胞接受IL-1β刺激后,細(xì)胞凋亡顯著增加。結(jié)論:通過本研究我們得到初步的結(jié)論是:IL-1β可激活c-Src蛋白激酶,后者再激活Stat3,從而增加胃腺癌MKN-45細(xì)胞的存活。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

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3 金焰;李明;孫文靜;于e，

本文編號：2297423