【摘要】：正常情況下,環(huán)境中多種有害因素,包括電離輻射(ionizing radiation, IR)、紫外線照射(ultraviolet irradiation, UV)和化學(xué)致癌劑等都可能導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷。隨著生物進(jìn)化,生物界產(chǎn)生了多種DNA修復(fù)途徑,例如堿基切除修復(fù)(base excision repair, BER)、核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair, NER)、同源重組(homologous recombination, HR)和非同源末端連接(no n-ho mo logo us end joining, NHEJ)等。DNA損傷修復(fù)對維護(hù)基因組完整性至關(guān)重要。DNA修復(fù)異常很可能導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性和細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。對DNA修復(fù)的長期深入研究,為臨床腫瘤治療提供了大量依據(jù)。DNA修復(fù)機(jī)制復(fù)雜多樣,是科學(xué)界的研究熱點(diǎn)之-中心體蛋白N1p (ninein-like protein)是我室通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)獲得的與BRCA1相關(guān)的蛋白。多項(xiàng)研究結(jié)果表明,Nlp能參與微管生發(fā)、紡錘體形成、中心體成熟以及胞質(zhì)分裂等多種生物學(xué)過程。雖然Nlp在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要的調(diào)控功能,是有絲分裂進(jìn)程所必需的。但是它在其他方面的功能還不清楚。本課題的前期工作中,我們用UV照射肺癌細(xì)胞系H1299后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Nlp的定位發(fā)生明顯改變。這提示我們Nlp可能參與UV導(dǎo)致的DNA損傷應(yīng)答。為了驗(yàn)證該假設(shè),我們通過宿主細(xì)胞再活化反應(yīng)(HCR)和CPDs移除速率檢測的方法,發(fā)現(xiàn)Nlp能夠促進(jìn)核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair, NER)通路的活性。為了進(jìn)一步研究Nlp的功能,我們利用兩種細(xì)胞系、Nlp轉(zhuǎn)基因小鼠與對照鼠MEF和新生小鼠皮膚分別進(jìn)行了UV照射后的細(xì)胞活性、克隆形成、流式凋亡以及原位凋亡檢測,發(fā)現(xiàn)Nlp具有保護(hù)細(xì)胞抵抗紫外線輻射引起的細(xì)胞凋亡的功能。為了探索其相關(guān)機(jī)制,我們通過UV局部照射的方法發(fā)現(xiàn)UV照射后Nlp定位到DNA損傷位點(diǎn)上。之后,通過核蛋白抽提、western blotting、co-IP、GST pull-down等方法,發(fā)現(xiàn)UV照射可導(dǎo)致Nlp向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。Nlp的入核受NPM1調(diào)控,且與p53無關(guān)。Nlp的C末端(1030-1382)介導(dǎo)了其與NPM1相互作用及其入核。另外,Nlp能夠分別與XPA和ERCC1相互作用,并且促進(jìn)兩者結(jié)合,從而發(fā)揮促進(jìn)DNA損傷修復(fù)的功能。除此之外,鑒于UV輻射與人皮膚癌的發(fā)生有明確相關(guān)性,我們通過免疫組化的方法,發(fā)現(xiàn)人皮膚癌樣本中Nlp蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對照組。這揭示了Nlp表達(dá)異常很可能參與人類皮膚癌的發(fā)生發(fā)展過程。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)并證明了細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Nlp是核苷酸切除修復(fù)(NER)通路中一個新的且重要的成員,從而為了解核苷酸切除修復(fù)通路的調(diào)控機(jī)制提供了新的見解,為腫瘤的治療提供了新的思路。
[Abstract]:Under normal circumstances, many harmful factors in the environment, including ionizing radiation (ionizing radiation, IR), ultraviolet irradiation of (ultraviolet irradiation, UV) and chemical carcinogens, may lead to cell DNA damage. As organisms evolve, the biological world produces a variety of DNA repair pathways. For example, base excision repair (base excision repair, BER), nucleotide excision repair (nucleotide excision repair, NER), homologous recombination (homologous recombination, HR) and non-homologous terminal junction (no n-ho mo logo us end joining, NHEJ), etc.) DNA damage repair is essential to maintain genomic integrity. DNA repair abnormality Which is likely to lead to genomic instability and malignant cell transformation. This in turn leads to tumorigenesis. The long-term in-depth study of DNA repair provides a large number of evidences for clinical tumor treatment. The mechanism of DNA repair is complex and diverse. Centrosomal protein N1p (ninein-like protein) is a protein related to BRCA1 obtained by yeast two-hybrid experiment in our laboratory. Many studies have shown that Nlp is involved in many biological processes, such as microtubule formation, spindle formation, centrosomal maturation and cytokinesis. Although Nlp plays an important regulatory role in cell cycle, it is necessary for mitosis. But its other functions are unclear. In our earlier work, we found that the localization of Nlp in lung cancer cell line H1299 was significantly changed after irradiation with UV. This suggests that our Nlp may be involved in the DNA damage response induced by UV. In order to verify this hypothesis, we found that Nlp can promote the activity of nucleotide excision repair (nucleotide excision repair, NER) pathway through the detection of (HCR) and CPDs removal rate of the host cell reactivation reaction. In order to further study the function of Nlp, we used two kinds of cell lines, Nlp transgenic mice, control mice, MEF and newborn mice skin, respectively, to observe the cell activity, clone formation, flow rate apoptosis and in situ apoptosis after UV irradiation. It was found that Nlp could protect cells from apoptosis induced by ultraviolet radiation. In order to explore its mechanism, we found that Nlp was located on the site of DNA damage after UV irradiation by means of local UV irradiation. Then, by means of nuclear protein extraction, western blotting,co-IP,GST pull-down and other methods, it was found that UV irradiation could induce the translocation of Nlp into the nucleus. The nucleation of Nlp was regulated by NPM1, and the C terminal of Nlp (1030-1382) mediated its interaction with NPM1 and its nuclear entry. In addition, Nlp can interact with XPA and ERCC1, and promote the combination of them, thus promoting the function of DNA damage repair. In addition, in view of the clear correlation between UV radiation and the occurrence of human skin cancer, we found that the expression of Nlp protein in human skin cancer samples was significantly lower than that in the normal control group by immunohistochemical method. This suggests that abnormal Nlp expression may be involved in the occurrence and development of human skin cancer. To sum up, this study has found and proved that the cell cycle regulatory protein Nlp is a new and important member of nucleotide excision repair (NER) pathway, thus providing a new understanding of the regulation mechanism of nucleotide excision repair pathway. It provides a new idea for the treatment of tumor.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.5

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2292725