【摘要】：背景和目的:檢測(cè)IGFBP2蛋白在胰腺癌患者血清和腫瘤組織中的表達(dá)狀況,結(jié)合患者臨床病理資料評(píng)估IGFBP2蛋白作為胰腺癌診斷和預(yù)后判讀標(biāo)記物的可能性;觀察IGFBP2對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移侵襲等生物學(xué)行為的影響,探討IGFBP2蛋白影響胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。方法:1.分別收集健康志愿者,慢性胰腺炎患者和胰腺癌患者治療前的血清標(biāo)本,使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中IGFBP2的表達(dá)水平,分析IGFBP2蛋白在各隊(duì)列中的差異性表達(dá),再結(jié)合臨床病理參數(shù)和ROC曲線評(píng)估比較IGFBP2與CA19-9在不同亞組患者中的表達(dá)情況和診斷效力,對(duì)病例資料進(jìn)行隨訪觀察,根據(jù)不同IGFBP2蛋白表達(dá)水平作生存分析;再對(duì)腫瘤組織進(jìn)行IGFBP2蛋白免疫組化染色,并結(jié)合臨床病理資料分析腫瘤組織中IGFBP2與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系并根據(jù)不同IGFBP2蛋白表達(dá)水平作生存分析;2.構(gòu)建IGFBP2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和干擾RNA、觀察不同IGFBP2表達(dá)水平對(duì)胰腺癌細(xì)胞株形態(tài)和生物學(xué)行為的影響,利用Western Blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)干擾與過(guò)表達(dá)IGFBP2后胰腺癌細(xì)胞EMT關(guān)鍵基因在蛋白水平的表達(dá)以及細(xì)胞定位情況;使用IGFBP2過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞構(gòu)建胰腺癌原位裸鼠模型,評(píng)估IGFBP2對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;3.使用c DNA微陣列技術(shù)對(duì)比IGFBP2穩(wěn)定過(guò)表達(dá)胰腺癌細(xì)胞和野生型胰腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)差異,并通過(guò)信號(hào)通路分析軟件IPA預(yù)測(cè)可能被激活的信號(hào)通路(本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NF-κB被激活);分別提取細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白,Western Blot檢測(cè)IGFBP2過(guò)表達(dá)和下調(diào)后NF-κB激活情況并使用免疫熒光進(jìn)行細(xì)胞定位檢測(cè),在臨床樣本組織切片中進(jìn)行IGFBP2,NF-κB的p65亞基和EMT重要基因進(jìn)行免疫組化染色,觀察各指標(biāo)表達(dá)是否具有相關(guān)性。最后聯(lián)合應(yīng)用IGFBP2重組蛋白、各信號(hào)通路抑制劑,基因修飾MEF細(xì)胞,PTEN突變質(zhì)粒及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)研究IGFBP2激活NF-κB的可能機(jī)制。結(jié)果:1.ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IGFBP2在胰腺癌中(435.7±234.2 ng/ml)較慢性胰腺炎(233.0±59.80 ng/ml)和健康人(289.9±148.2 ng/ml)明顯表達(dá)升高(P值均0.05),并且該差異性在對(duì)年齡和性別進(jìn)行校準(zhǔn)后依然存在。IGFBP2根據(jù)患者臨床資料進(jìn)行亞組分析發(fā)現(xiàn),IGFBP2較CA19-9在伴發(fā)糖尿病情況,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)侵犯各亞組有明顯差異,ROC曲線顯示IGFBP2聯(lián)合CA19-9較二者單獨(dú)使用可以明顯提高胰腺癌的診斷率(AUC值0.921),且IGFBP2較CA19-9能更好的鑒別慢性胰腺炎和胰腺癌(AUC值0.817 vs0.770,P0.05);IGFBP2升高是胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo),以333.9ng/ml為截?cái)嘀?Kaplan-Meier曲線發(fā)現(xiàn)IGFBP2升高患者預(yù)后明顯較差(中位生存期13月vs 8月,P0.05)。通過(guò)對(duì)上述隊(duì)列胰腺癌組織病理切片的IGFBP2蛋白免疫組化染色發(fā)現(xiàn),71例(94.6%)病理切片中胰腺癌細(xì)胞IGFBP2蛋白表達(dá)陽(yáng)性;Logistic回歸分析顯示:胰腺癌組織中IGFBP2蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,生存時(shí)間相關(guān),生存分析顯示免疫組化間質(zhì)細(xì)胞染色評(píng)分大于6分的患者生存期與評(píng)分小于6分的患者相比有顯著性差異(中位生存期9月vs 16.1月,P0.05)。2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生物學(xué)行為觀察結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,胰腺癌IGFBP2過(guò)表達(dá)細(xì)胞形態(tài)明顯由上皮細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變,且細(xì)胞遷移(P0.05)及侵襲能力增強(qiáng)(P0.05);而IGFBP2下調(diào)后細(xì)胞形態(tài)呈明顯上皮樣改變,細(xì)胞遷移侵襲能力減弱;兩組細(xì)胞增殖未見(jiàn)明顯改變;IGFBP2上調(diào)后,E-cadherin和Vimentin呈上皮-間質(zhì)樣定量定位改變,而IGFBP2下調(diào)則呈相反改變;動(dòng)物胰腺癌原位模型顯示IGFBP2過(guò)表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生腸系膜根部轉(zhuǎn)移。3.c DNA微陣列顯示IGFBP2過(guò)表達(dá)后,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要基因Snail,Vimentin,Ecadherin在轉(zhuǎn)錄水平呈明顯EMT轉(zhuǎn)化趨勢(shì)改變,信號(hào)通路分析顯示IGFBP2激活后NF-κB信號(hào)通路可能被激活(P0.001)。免疫熒光及核蛋白的Western Blot顯示IGFBP2上調(diào)后,核內(nèi)的p65亞基及其磷酸化形式明顯增多,NF-κB被激活并伴隨E-cadherin的減少和Vimentin的增多,相反IGFBP2下調(diào)后核p65明顯減少NF-κB激活受到抑制伴隨E-cadherin的增多和Vimentin的減少,臨床樣本連續(xù)切片組化染色提示IGFBP2與p65,E-cadherin和Vimentin表達(dá)明顯相關(guān)。NF-κB被抑制后,IGFBP2升高也無(wú)法引起EMT和細(xì)胞侵襲遷移能力的增加。當(dāng)PTEN/PI3K/Akt通路被抑制或IKKβ被敲除后,IGFBP2無(wú)法引起p65入核進(jìn)而激活NF-κB引起EMT。結(jié)論:1.IGFBP2在胰腺癌患者血清和腫瘤組織中特異性升高,其升高程度與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,神經(jīng)侵犯以及預(yù)后相關(guān),是一種對(duì)診斷胰腺癌和判斷患者預(yù)后有價(jià)值的生物標(biāo)記物。2.IGFBP2升高會(huì)引起胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng),這種現(xiàn)象是通過(guò)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)所致。IGFBP2是通過(guò)激NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)EMT發(fā)生的。3.IGFBP2是通過(guò)抑制同源性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)表達(dá),激活PI3K/Akt信號(hào)通路,繼而磷酸化激活I(lǐng)KK激酶β(IKKβ),磷酸化降解NF-κB阻扼蛋白I-κB,促進(jìn)p65入細(xì)胞核激活NF-κB。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.9

【共引文獻(xiàn)】

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1 趙爽;關(guān)于CD147通過(guò)IGFBP2調(diào)控惡性黑色素瘤凋亡的體內(nèi)外相關(guān)研究[D];中南大學(xué);2013年

2 林國(guó)強(qiáng);IGFBP-2調(diào)控非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成的初步研究[D];中南大學(xué);2013年

3 胡國(guó)章;利用生物信息學(xué)方法篩選膠質(zhì)瘤的差異表達(dá)基因及其相關(guān)機(jī)制[D];吉林大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 趙文月;miR-140通過(guò)下調(diào)Smad3抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力[D];大連醫(yī)科大學(xué);2014年

2 吳魏芹;肺癌病人血漿IGFBP-2的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及其臨床意義[D];南京醫(yī)科大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：2290976