發(fā)布時間：2018-10-23 21:09

【摘要】：第一部分HBx在代謝應(yīng)激條件下對肝癌細(xì)胞存活的調(diào)控和機(jī)制研究研究目的原發(fā)性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界六大常見惡性腫瘤之一,其病死率高居世界第二位。雖然手術(shù)切除和肝移植是治療HCC的有效手段,但大多數(shù)的患者發(fā)現(xiàn)時多為晚期,已經(jīng)無法再進(jìn)行手術(shù)治療。在我國,雖然肝癌發(fā)生的誘因很多,但慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染與肝硬化以及肝癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系,是肝癌發(fā)生的最主要的危險因素。HBV感染的肝癌患者一般經(jīng)歷病毒感染、肝硬化和肝癌的三個主要階段。雖然目前研究眾多,但HBV感染后如何進(jìn)一步導(dǎo)致肝癌的發(fā)生,或者說HBV在肝癌發(fā)展過程中起到什么作用仍不清楚。目前已知HBV基因組中開放式閱讀框架X區(qū)編碼的x蛋白(HBx)是一種大小約17k Da、可溶性的多功能蛋白。其可以通過與宿主細(xì)胞內(nèi)多種功能蛋白以間接或直接的方式相互作用,或者通過反式激活的方式參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖凋亡、周期改變等多個細(xì)胞病理生理過程。有研究證實(shí)HBx在HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了非常重要的作用。然而HBx通過怎樣的機(jī)制、并以如何的方式參與調(diào)控肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程卻仍有待進(jìn)一步研究。癌基因的異常過度活化以及抑癌基因的抑制失活會引起細(xì)胞代謝重編程。對于腫瘤細(xì)胞而言,最常見的代謝表型改變是糖酵解水平的增強(qiáng):即細(xì)胞通過大量消耗葡萄糖進(jìn)行無氧糖酵解進(jìn)而為細(xì)胞存活和增殖提供必須的能量。但同時由于代謝重編程導(dǎo)致對營養(yǎng)物質(zhì)、尤其是葡萄糖的高消耗和腫瘤相對生長過快引起的血供不足,肝癌細(xì)胞往往長時間處于慢性的相對缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)相對缺乏的代謝應(yīng)激環(huán)境中。這種情況下,腫瘤細(xì)胞需要調(diào)整其自身代謝方式,從而適應(yīng)惡劣的外界環(huán)境和應(yīng)激刺激。其中,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可通過增強(qiáng)脂肪酸氧化過程來為細(xì)胞在應(yīng)激條件下的存活提供必需的能量和代謝底物。既往也有研究證實(shí),HBx能夠調(diào)控脂質(zhì)代謝并參與肝癌發(fā)生發(fā)展過程,但在代謝應(yīng)激尤其是糖缺失的情況下,HBx如何調(diào)控肝癌細(xì)胞的代謝方式以及在維持肝癌細(xì)胞存活等方面起到怎么樣的作用,卻鮮有研究報(bào)道。結(jié)合上述問題,本研究全面系統(tǒng)地研究了HBx在減糖代謝應(yīng)激的情況下維持肝癌細(xì)胞存活的調(diào)控途徑和相應(yīng)的作用機(jī)制,并進(jìn)一步在動物體內(nèi)模型和臨床肝癌標(biāo)本中模擬體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行了充分的驗(yàn)證,相關(guān)研究在國內(nèi)外暫時未看到詳細(xì)的報(bào)道。因此,我們的研究將有助于進(jìn)一步闡明HBx在HBV相關(guān)肝癌的進(jìn)展過程中所起到的作用和意義,也從脂質(zhì)代謝的角度上為HBV相關(guān)肝癌的防治提供了新的思路。研究方法1、建立HBx過表達(dá),以及在過表達(dá)細(xì)胞系基礎(chǔ)上si RNA干擾HBx表達(dá)的肝癌細(xì)胞系,并在RNA水平和蛋白水平驗(yàn)證效果;2、分別在不同營養(yǎng)應(yīng)激條件下培養(yǎng)上述肝癌細(xì)胞系,比較過表達(dá)HBx在不同的處理?xiàng)l件下對肝癌細(xì)胞存活率的影響;3、分別在正常培養(yǎng)和減糖應(yīng)激的情況下通過體外克隆形成實(shí)驗(yàn)比較肝癌細(xì)胞在過表達(dá)HBX之后克隆形成、細(xì)胞存活能力的差異;4、分別在正常培養(yǎng)和減糖應(yīng)激的情況下研究HBx過表達(dá)后對細(xì)胞內(nèi)ROS水平、GSH含量、NADPH水平以及ATP含量的影響;5、通過代謝流量儀檢測HBx過表達(dá)后在正常情況下對肝癌細(xì)胞糖酵解能力和線粒體氧化呼吸能力的影響,以及在減糖應(yīng)激情況下對細(xì)胞脂質(zhì)進(jìn)行氧化分解的潛能;6、通過蛋白免疫印跡法檢測在減糖應(yīng)激情況下HBx過表達(dá)對肝癌細(xì)胞AMPK信號通路的活化的情況;7、通過流式細(xì)胞術(shù)檢測在減糖應(yīng)激情況下HBx表達(dá)對胞內(nèi)鈣離子含量水平的影響,以及蛋白免疫印跡法檢測給予鈣離子通道抑制劑后HBx對AMPK信號通路的活化情況的影響;8、通過裸鼠皮下成瘤以及腹腔給藥抑制脂質(zhì)氧化代謝的實(shí)驗(yàn)檢測HBx體內(nèi)成瘤性以及脂質(zhì)代謝在HBx相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用;9、臨床肝癌標(biāo)本中檢測HBx表達(dá)、AMPK信號通路活化程度以及脂質(zhì)氧化分解水平之間的相關(guān)性。結(jié)果1、HBx的表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞在減糖應(yīng)激的情況下的存活,但不影響細(xì)胞在無谷氨酰胺或無血清情況下的存活能力;2、在減糖應(yīng)激情況下HBx過表達(dá)可控制細(xì)胞ROS水平,維持GSH和NADPH含量;3、HBx過表達(dá)可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞在H2O2以及缺氧誘導(dǎo)氧化應(yīng)激情況下的抗氧化能力;4、在減糖應(yīng)激情況下HBx過表達(dá)可維持胞內(nèi)ATP含量,保持能量穩(wěn)態(tài)平衡;5、在正常培養(yǎng)情況下HBx過表達(dá)并不能影響肝癌細(xì)胞糖攝取、乳酸生成、糖酵解以及線粒體氧化呼吸功能;6、在減糖應(yīng)激情況下HBx過表達(dá)增強(qiáng)AMPK信號通路的磷酸化水平,并激活脂質(zhì)氧化分解途徑;7、HBx介導(dǎo)的脂質(zhì)氧化分解增強(qiáng)可為肝癌細(xì)胞提供能量和代謝底物,進(jìn)而促進(jìn)其在減糖應(yīng)激條件下存活;8、在減糖應(yīng)激情況下HBx過表達(dá)主要通過激活Ca2+/Ca MKK軸來促進(jìn)AMPK信號通路的活化;9、在體內(nèi)環(huán)境中HBx過表達(dá)可促進(jìn)腫瘤形成和發(fā)展,但抑制脂質(zhì)氧化過程可逆轉(zhuǎn)HBx過表達(dá)肝癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤優(yōu)勢;10、在臨床肝癌樣本中HBx的表達(dá)量與AMPK信號通路以及脂質(zhì)氧化分解過程的激活程度明顯相關(guān)。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)HBx在代謝應(yīng)激的情況下可以通過激活脂質(zhì)氧化分解過程來提供ATP和NADPH以維持胞內(nèi)能量和氧化還原穩(wěn)態(tài),進(jìn)而維持肝癌細(xì)胞在減糖應(yīng)激情況下的存活情況。即具體分子機(jī)制為,HBx在代謝應(yīng)激情況下通過激活Ca2+/Ca MKK軸來活化AMPK信號通路,進(jìn)而增強(qiáng)脂質(zhì)氧化分解途徑。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)抑制脂質(zhì)氧化分解可逆轉(zhuǎn)HBx介導(dǎo)的生長優(yōu)勢,同樣在臨床肝癌樣本中也發(fā)現(xiàn)HBx的表達(dá)水平與AMPK通路以及脂質(zhì)氧化分解途徑的活化程度密切相關(guān)。第二部分乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-Co A carboxylaseα,ACCα)介導(dǎo)的脂質(zhì)從頭合成促進(jìn)肝癌細(xì)胞在代謝應(yīng)激條件下存活的研究研究背景和目的原發(fā)性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是全世界致死率最高的三大惡性腫瘤之一,其惡性程度非常高、預(yù)后也極差,5年內(nèi)患者的復(fù)發(fā)率甚至能高達(dá)70%。很多病人發(fā)現(xiàn)時已是晚期,無法手術(shù)治療,只能采用放療或靶向治療。雖然隨著診斷和治療技術(shù)的不斷提高,肝癌的早期診斷和治療已取得了較大進(jìn)展,但由于肝癌在臨床表現(xiàn)以及生物學(xué)特性上有非常大的異質(zhì)性,難以根據(jù)腫瘤特性進(jìn)行分類分型以利于指導(dǎo)治療,因此大多數(shù)的肝癌患者的臨床治療效果并不理想,患者預(yù)后仍較差。鑒于此,根據(jù)肝癌的某方面或者某些方面的生物學(xué)性質(zhì)對其進(jìn)行亞群分型或者分類來指導(dǎo)腫瘤治療則顯得十分迫切。從代謝角度來看,很多腫瘤細(xì)胞往往表現(xiàn)出某些共同的代謝表型,比如糖酵解途徑的增強(qiáng)。但更多的是不同腫瘤表現(xiàn)出不同類型的異常代謝特征。已有研究表明,很多情況下腫瘤細(xì)胞代謝表型的改變多伴有相應(yīng)癌基因或抑癌基因的異常突變。其中,由癌基因介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝重編程已逐漸引起人們興趣并被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞重要的代謝異常表型之一。因此,進(jìn)一步深入了解由這些基因引起的代謝異常表型將有助于科學(xué)家們更好的對腫瘤細(xì)胞以代謝特征來進(jìn)行分群,從而也促進(jìn)腫瘤治療新藥和新靶點(diǎn)的研究與開發(fā)。在體內(nèi)實(shí)體惡性腫瘤的形成和進(jìn)展過程中,腫瘤細(xì)胞由于糖酵解大量消耗營養(yǎng)物質(zhì)并且血供相對不足,所以處于長期應(yīng)激的微環(huán)境。這樣不利的存活條件往往需要肝癌細(xì)胞改變其自身的代謝模式,進(jìn)而不斷獲得維持自身存活下去的能量和代謝底物,最終逐漸適應(yīng)這樣的外界微環(huán)境。已有研究證實(shí)肝癌細(xì)胞的脂質(zhì)代謝能力增強(qiáng),并促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。然而,在代謝應(yīng)激的環(huán)境下,脂質(zhì)合成代謝是怎樣影響肝癌生物學(xué)特性、以及這種代謝特征對肝癌細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的存活起到什么樣的作用仍有待進(jìn)一步闡明。本課題研究的主要目的是探討在營養(yǎng)應(yīng)激的微環(huán)境下脂質(zhì)合成代謝途徑對肝癌細(xì)胞存活的影響以及其具體的調(diào)控機(jī)制,進(jìn)而找到并通過代謝表型來對不同的肝癌患者進(jìn)行分型分類。同時,我們的研究也從脂質(zhì)代謝途徑為肝癌的個性化治療提供了新的分子靶點(diǎn)和研究思路。實(shí)驗(yàn)方法1、從臨床肝癌樣本中分離原代肝癌細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)方式檢測細(xì)胞脂質(zhì)含量和糖攝取能力;2、在減糖應(yīng)激處理24小時的情況下檢測原代肝癌細(xì)胞存活率,分別與其脂質(zhì)含量和糖攝取水平進(jìn)行相關(guān)性分析;3、通過外源性脂肪酸攝取實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞對外源脂質(zhì)攝取利用情況;4、在體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞系,通過去除FBS模擬無外源性脂質(zhì)的情況,利用外源性棕櫚酸代替FBS,分別在有糖和無糖的情況下檢測有無外源性棕櫚酸對脂質(zhì)合成的影響以及對細(xì)胞存活的影響;5、在原代肝癌細(xì)胞中通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測ACCα表達(dá)水平,并分別將其跟胞內(nèi)脂質(zhì)、糖攝取能力、減糖應(yīng)激情況下存活能力進(jìn)行相關(guān)性分析;6、建立穩(wěn)定過表達(dá)和干擾ACCα的肝癌細(xì)胞系,檢測ACCα干擾或過表達(dá)對細(xì)胞脂質(zhì)含量、糖攝取能力以及在減糖應(yīng)激情況下的存活能力的影響;7、通過細(xì)胞代謝流量分析儀檢測ACCα干擾或過表達(dá)后肝癌細(xì)胞在減糖應(yīng)激情況下利用脂質(zhì)進(jìn)行氧化分解的能力;8、分別在正常情況和應(yīng)激狀態(tài)下通過免疫共沉淀方法檢測肝癌細(xì)胞中內(nèi)源性和外源性ACCα與CPT1A之間的相互作用;9、分離胞內(nèi)線粒體,分別在正常和應(yīng)激情況下檢測CPT1A在胞內(nèi)和線粒體定位的含量變化;10、通過DEN誘癌大鼠和小鼠模型檢測ACCα在肝癌中的表達(dá)情況,以及對脂質(zhì)含量和糖攝取能力的影響;11、通過免疫組化檢測肝癌樣品芯片中癌組織以及對應(yīng)癌旁組織中ACCα的表達(dá)含量,在患者中分析ACCα表達(dá)與不同臨床惡性表型之間的關(guān)系;12、分析ACCα對肝癌患者總體生存期還有無瘤生存期的影響,單因素以及多因素分析ACCα在判斷肝癌患者復(fù)發(fā)以及預(yù)后中的意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、肝癌細(xì)胞脂質(zhì)含量主要來自于經(jīng)過葡萄糖來源的從頭合成的過程;2、肝癌細(xì)胞中脂質(zhì)從頭合成水平具有較大異質(zhì)性,而這種從頭合成的能力與肝癌細(xì)胞在減糖應(yīng)激情況下的存活情況密切相關(guān);3、肝癌細(xì)胞中ACCα的表達(dá)水平?jīng)Q定了其脂質(zhì)從頭合成水平的異質(zhì)性,并與肝癌細(xì)胞在減糖應(yīng)激情況下的存活能力密切相關(guān);4、干擾ACCα表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞通過利用葡萄糖進(jìn)行脂質(zhì)的從頭合成,并使肝癌細(xì)胞對減糖應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡更敏感,而過表達(dá)ACCα則可以促進(jìn)脂質(zhì)從頭合成并保護(hù)細(xì)胞在減糖應(yīng)激情況下存活;5、ACCα的過表達(dá)或干擾并不能直接影響肝癌細(xì)胞對外源性脂肪酸的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn);6、在營養(yǎng)應(yīng)激饑餓處理的情況,ACCα的表達(dá)可以改變肝癌細(xì)胞利用脂質(zhì)進(jìn)行氧化分解的能力;7、ACCα可以與脂質(zhì)氧化分解關(guān)鍵酶CPT1A相互作用,并且在減糖應(yīng)激情況下兩者相互作用減弱,從而使釋放游離的CPT1A重新定位結(jié)合在線粒體膜上,進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)氧化分解過程;8、ACCα在DEN誘癌的大鼠和小鼠模型的肝癌組織樣品中有較高的表達(dá),并能促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化的肝癌細(xì)胞利用葡萄糖通過從頭合成途徑合成脂質(zhì);9、ACCα高表達(dá)的臨床肝癌樣本更具有侵襲性的生物學(xué)特性和臨床表型;臨床肝癌標(biāo)本中ACCα高表達(dá)可以顯著促進(jìn)肝癌的發(fā)生、進(jìn)展以及惡性侵襲;10、ACCα高表達(dá)是影響肝癌患者術(shù)后無瘤生存期和總生存期的重要獨(dú)立危險因素,ACCα的表達(dá)水平能夠作為肝癌患者復(fù)發(fā)和預(yù)后的有效預(yù)測指標(biāo)。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中脂質(zhì)含量主要來自于利用葡萄糖進(jìn)行的脂質(zhì)從頭合成途徑,而非直接攝取外源性脂肪酸進(jìn)行加工合成。同時,肝癌細(xì)胞中脂質(zhì)從頭合成水平有較大的異質(zhì)性,并且與肝癌細(xì)胞在代謝應(yīng)激情況下的存活能力密切相關(guān)。在分子層面上,我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)合成關(guān)鍵限速酶ACCα的表達(dá)一定程度上決定了這種脂質(zhì)從頭合成的水平,并且與細(xì)胞在應(yīng)激情況下存活能力密切相關(guān)。即ACCα在正常培養(yǎng)條件下可促進(jìn)脂質(zhì)合成并儲存,而在減糖應(yīng)激狀態(tài)下可促進(jìn)脂質(zhì)氧化分解供能利用細(xì)胞存活。其具體機(jī)制是,ACCα可以與脂質(zhì)氧化分解關(guān)鍵限速酶CPT1A相互結(jié)合,并在減糖應(yīng)激環(huán)境下結(jié)合作用降低,游離的CPT1A重新定位于線粒體進(jìn)而激活脂質(zhì)氧化途徑。我們進(jìn)一步在DEN誘癌模型中證實(shí)ACCα在腫瘤組織中高表達(dá)并能促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化肝癌細(xì)胞利用葡萄糖進(jìn)行脂質(zhì)從頭合成。最后在肝癌臨床樣本中,ACCα的高表達(dá)與腫瘤臨床惡性、侵襲性病理特征表型密切相關(guān),并且ACCα高表達(dá)的患者其更容易復(fù)發(fā)、生存時間更短、預(yù)后更差。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 Joachim Lupberger;Eberhard Hildt;;Hepatitis B virus-induced oncogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2007年01期

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本文編號：2290465