發(fā)布時間：2018-10-23 21:09

【摘要】：第一部分HBx在代謝應激條件下對肝癌細胞存活的調控和機制研究研究目的原發(fā)性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界六大常見惡性腫瘤之一,其病死率高居世界第二位。雖然手術切除和肝移植是治療HCC的有效手段,但大多數的患者發(fā)現時多為晚期,已經無法再進行手術治療。在我國,雖然肝癌發(fā)生的誘因很多,但慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染與肝硬化以及肝癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關系,是肝癌發(fā)生的最主要的危險因素。HBV感染的肝癌患者一般經歷病毒感染、肝硬化和肝癌的三個主要階段。雖然目前研究眾多,但HBV感染后如何進一步導致肝癌的發(fā)生,或者說HBV在肝癌發(fā)展過程中起到什么作用仍不清楚。目前已知HBV基因組中開放式閱讀框架X區(qū)編碼的x蛋白(HBx)是一種大小約17k Da、可溶性的多功能蛋白。其可以通過與宿主細胞內多種功能蛋白以間接或直接的方式相互作用,或者通過反式激活的方式參與調控基因轉錄、信號轉導、增殖凋亡、周期改變等多個細胞病理生理過程。有研究證實HBx在HBV相關肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了非常重要的作用。然而HBx通過怎樣的機制、并以如何的方式參與調控肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程卻仍有待進一步研究。癌基因的異常過度活化以及抑癌基因的抑制失活會引起細胞代謝重編程。對于腫瘤細胞而言,最常見的代謝表型改變是糖酵解水平的增強:即細胞通過大量消耗葡萄糖進行無氧糖酵解進而為細胞存活和增殖提供必須的能量。但同時由于代謝重編程導致對營養(yǎng)物質、尤其是葡萄糖的高消耗和腫瘤相對生長過快引起的血供不足,肝癌細胞往往長時間處于慢性的相對缺氧、營養(yǎng)物質相對缺乏的代謝應激環(huán)境中。這種情況下,腫瘤細胞需要調整其自身代謝方式,從而適應惡劣的外界環(huán)境和應激刺激。其中,有學者發(fā)現腫瘤細胞可通過增強脂肪酸氧化過程來為細胞在應激條件下的存活提供必需的能量和代謝底物。既往也有研究證實,HBx能夠調控脂質代謝并參與肝癌發(fā)生發(fā)展過程,但在代謝應激尤其是糖缺失的情況下,HBx如何調控肝癌細胞的代謝方式以及在維持肝癌細胞存活等方面起到怎么樣的作用,卻鮮有研究報道。結合上述問題,本研究全面系統(tǒng)地研究了HBx在減糖代謝應激的情況下維持肝癌細胞存活的調控途徑和相應的作用機制,并進一步在動物體內模型和臨床肝癌標本中模擬體內環(huán)境進行了充分的驗證,相關研究在國內外暫時未看到詳細的報道。因此,我們的研究將有助于進一步闡明HBx在HBV相關肝癌的進展過程中所起到的作用和意義,也從脂質代謝的角度上為HBV相關肝癌的防治提供了新的思路。研究方法1、建立HBx過表達,以及在過表達細胞系基礎上si RNA干擾HBx表達的肝癌細胞系,并在RNA水平和蛋白水平驗證效果;2、分別在不同營養(yǎng)應激條件下培養(yǎng)上述肝癌細胞系,比較過表達HBx在不同的處理條件下對肝癌細胞存活率的影響;3、分別在正常培養(yǎng)和減糖應激的情況下通過體外克隆形成實驗比較肝癌細胞在過表達HBX之后克隆形成、細胞存活能力的差異;4、分別在正常培養(yǎng)和減糖應激的情況下研究HBx過表達后對細胞內ROS水平、GSH含量、NADPH水平以及ATP含量的影響;5、通過代謝流量儀檢測HBx過表達后在正常情況下對肝癌細胞糖酵解能力和線粒體氧化呼吸能力的影響,以及在減糖應激情況下對細胞脂質進行氧化分解的潛能;6、通過蛋白免疫印跡法檢測在減糖應激情況下HBx過表達對肝癌細胞AMPK信號通路的活化的情況;7、通過流式細胞術檢測在減糖應激情況下HBx表達對胞內鈣離子含量水平的影響,以及蛋白免疫印跡法檢測給予鈣離子通道抑制劑后HBx對AMPK信號通路的活化情況的影響;8、通過裸鼠皮下成瘤以及腹腔給藥抑制脂質氧化代謝的實驗檢測HBx體內成瘤性以及脂質代謝在HBx相關腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用;9、臨床肝癌標本中檢測HBx表達、AMPK信號通路活化程度以及脂質氧化分解水平之間的相關性。結果1、HBx的表達可促進肝癌細胞在減糖應激的情況下的存活,但不影響細胞在無谷氨酰胺或無血清情況下的存活能力;2、在減糖應激情況下HBx過表達可控制細胞ROS水平,維持GSH和NADPH含量;3、HBx過表達可增強肝癌細胞在H2O2以及缺氧誘導氧化應激情況下的抗氧化能力;4、在減糖應激情況下HBx過表達可維持胞內ATP含量,保持能量穩(wěn)態(tài)平衡;5、在正常培養(yǎng)情況下HBx過表達并不能影響肝癌細胞糖攝取、乳酸生成、糖酵解以及線粒體氧化呼吸功能;6、在減糖應激情況下HBx過表達增強AMPK信號通路的磷酸化水平,并激活脂質氧化分解途徑;7、HBx介導的脂質氧化分解增強可為肝癌細胞提供能量和代謝底物,進而促進其在減糖應激條件下存活;8、在減糖應激情況下HBx過表達主要通過激活Ca2+/Ca MKK軸來促進AMPK信號通路的活化;9、在體內環(huán)境中HBx過表達可促進腫瘤形成和發(fā)展,但抑制脂質氧化過程可逆轉HBx過表達肝癌細胞的體內成瘤優(yōu)勢;10、在臨床肝癌樣本中HBx的表達量與AMPK信號通路以及脂質氧化分解過程的激活程度明顯相關。結論本研究發(fā)現HBx在代謝應激的情況下可以通過激活脂質氧化分解過程來提供ATP和NADPH以維持胞內能量和氧化還原穩(wěn)態(tài),進而維持肝癌細胞在減糖應激情況下的存活情況。即具體分子機制為,HBx在代謝應激情況下通過激活Ca2+/Ca MKK軸來活化AMPK信號通路,進而增強脂質氧化分解途徑。體內成瘤實驗進一步證實抑制脂質氧化分解可逆轉HBx介導的生長優(yōu)勢,同樣在臨床肝癌樣本中也發(fā)現HBx的表達水平與AMPK通路以及脂質氧化分解途徑的活化程度密切相關。第二部分乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-Co A carboxylaseα,ACCα)介導的脂質從頭合成促進肝癌細胞在代謝應激條件下存活的研究研究背景和目的原發(fā)性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是全世界致死率最高的三大惡性腫瘤之一,其惡性程度非常高、預后也極差,5年內患者的復發(fā)率甚至能高達70%。很多病人發(fā)現時已是晚期,無法手術治療,只能采用放療或靶向治療。雖然隨著診斷和治療技術的不斷提高,肝癌的早期診斷和治療已取得了較大進展,但由于肝癌在臨床表現以及生物學特性上有非常大的異質性,難以根據腫瘤特性進行分類分型以利于指導治療,因此大多數的肝癌患者的臨床治療效果并不理想,患者預后仍較差。鑒于此,根據肝癌的某方面或者某些方面的生物學性質對其進行亞群分型或者分類來指導腫瘤治療則顯得十分迫切。從代謝角度來看,很多腫瘤細胞往往表現出某些共同的代謝表型,比如糖酵解途徑的增強。但更多的是不同腫瘤表現出不同類型的異常代謝特征。已有研究表明,很多情況下腫瘤細胞代謝表型的改變多伴有相應癌基因或抑癌基因的異常突變。其中,由癌基因介導的脂質代謝重編程已逐漸引起人們興趣并被認為是腫瘤細胞重要的代謝異常表型之一。因此,進一步深入了解由這些基因引起的代謝異常表型將有助于科學家們更好的對腫瘤細胞以代謝特征來進行分群,從而也促進腫瘤治療新藥和新靶點的研究與開發(fā)。在體內實體惡性腫瘤的形成和進展過程中,腫瘤細胞由于糖酵解大量消耗營養(yǎng)物質并且血供相對不足,所以處于長期應激的微環(huán)境。這樣不利的存活條件往往需要肝癌細胞改變其自身的代謝模式,進而不斷獲得維持自身存活下去的能量和代謝底物,最終逐漸適應這樣的外界微環(huán)境。已有研究證實肝癌細胞的脂質代謝能力增強,并促進肝癌的進展。然而,在代謝應激的環(huán)境下,脂質合成代謝是怎樣影響肝癌生物學特性、以及這種代謝特征對肝癌細胞在應激狀態(tài)下的存活起到什么樣的作用仍有待進一步闡明。本課題研究的主要目的是探討在營養(yǎng)應激的微環(huán)境下脂質合成代謝途徑對肝癌細胞存活的影響以及其具體的調控機制,進而找到并通過代謝表型來對不同的肝癌患者進行分型分類。同時,我們的研究也從脂質代謝途徑為肝癌的個性化治療提供了新的分子靶點和研究思路。實驗方法1、從臨床肝癌樣本中分離原代肝癌細胞,通過流式細胞術方式檢測細胞脂質含量和糖攝取能力;2、在減糖應激處理24小時的情況下檢測原代肝癌細胞存活率,分別與其脂質含量和糖攝取水平進行相關性分析;3、通過外源性脂肪酸攝取實驗檢測肝癌細胞對外源脂質攝取利用情況;4、在體外培養(yǎng)肝癌細胞系,通過去除FBS模擬無外源性脂質的情況,利用外源性棕櫚酸代替FBS,分別在有糖和無糖的情況下檢測有無外源性棕櫚酸對脂質合成的影響以及對細胞存活的影響;5、在原代肝癌細胞中通過蛋白免疫印跡實驗檢測ACCα表達水平,并分別將其跟胞內脂質、糖攝取能力、減糖應激情況下存活能力進行相關性分析;6、建立穩(wěn)定過表達和干擾ACCα的肝癌細胞系,檢測ACCα干擾或過表達對細胞脂質含量、糖攝取能力以及在減糖應激情況下的存活能力的影響;7、通過細胞代謝流量分析儀檢測ACCα干擾或過表達后肝癌細胞在減糖應激情況下利用脂質進行氧化分解的能力;8、分別在正常情況和應激狀態(tài)下通過免疫共沉淀方法檢測肝癌細胞中內源性和外源性ACCα與CPT1A之間的相互作用;9、分離胞內線粒體,分別在正常和應激情況下檢測CPT1A在胞內和線粒體定位的含量變化;10、通過DEN誘癌大鼠和小鼠模型檢測ACCα在肝癌中的表達情況,以及對脂質含量和糖攝取能力的影響;11、通過免疫組化檢測肝癌樣品芯片中癌組織以及對應癌旁組織中ACCα的表達含量,在患者中分析ACCα表達與不同臨床惡性表型之間的關系;12、分析ACCα對肝癌患者總體生存期還有無瘤生存期的影響,單因素以及多因素分析ACCα在判斷肝癌患者復發(fā)以及預后中的意義。實驗結果1、肝癌細胞脂質含量主要來自于經過葡萄糖來源的從頭合成的過程;2、肝癌細胞中脂質從頭合成水平具有較大異質性,而這種從頭合成的能力與肝癌細胞在減糖應激情況下的存活情況密切相關;3、肝癌細胞中ACCα的表達水平決定了其脂質從頭合成水平的異質性,并與肝癌細胞在減糖應激情況下的存活能力密切相關;4、干擾ACCα表達可抑制肝癌細胞通過利用葡萄糖進行脂質的從頭合成,并使肝癌細胞對減糖應激引起的細胞死亡更敏感,而過表達ACCα則可以促進脂質從頭合成并保護細胞在減糖應激情況下存活;5、ACCα的過表達或干擾并不能直接影響肝癌細胞對外源性脂肪酸的攝取和轉運;6、在營養(yǎng)應激饑餓處理的情況,ACCα的表達可以改變肝癌細胞利用脂質進行氧化分解的能力;7、ACCα可以與脂質氧化分解關鍵酶CPT1A相互作用,并且在減糖應激情況下兩者相互作用減弱,從而使釋放游離的CPT1A重新定位結合在線粒體膜上,進而促進脂質氧化分解過程;8、ACCα在DEN誘癌的大鼠和小鼠模型的肝癌組織樣品中有較高的表達,并能促進惡性轉化的肝癌細胞利用葡萄糖通過從頭合成途徑合成脂質;9、ACCα高表達的臨床肝癌樣本更具有侵襲性的生物學特性和臨床表型;臨床肝癌標本中ACCα高表達可以顯著促進肝癌的發(fā)生、進展以及惡性侵襲;10、ACCα高表達是影響肝癌患者術后無瘤生存期和總生存期的重要獨立危險因素,ACCα的表達水平能夠作為肝癌患者復發(fā)和預后的有效預測指標。結論本研究發(fā)現在肝癌細胞中脂質含量主要來自于利用葡萄糖進行的脂質從頭合成途徑,而非直接攝取外源性脂肪酸進行加工合成。同時,肝癌細胞中脂質從頭合成水平有較大的異質性,并且與肝癌細胞在代謝應激情況下的存活能力密切相關。在分子層面上,我們發(fā)現脂質合成關鍵限速酶ACCα的表達一定程度上決定了這種脂質從頭合成的水平,并且與細胞在應激情況下存活能力密切相關。即ACCα在正常培養(yǎng)條件下可促進脂質合成并儲存,而在減糖應激狀態(tài)下可促進脂質氧化分解供能利用細胞存活。其具體機制是,ACCα可以與脂質氧化分解關鍵限速酶CPT1A相互結合,并在減糖應激環(huán)境下結合作用降低,游離的CPT1A重新定位于線粒體進而激活脂質氧化途徑。我們進一步在DEN誘癌模型中證實ACCα在腫瘤組織中高表達并能促進惡性轉化肝癌細胞利用葡萄糖進行脂質從頭合成。最后在肝癌臨床樣本中,ACCα的高表達與腫瘤臨床惡性、侵襲性病理特征表型密切相關,并且ACCα高表達的患者其更容易復發(fā)、生存時間更短、預后更差。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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1 Joachim Lupberger;Eberhard Hildt;;Hepatitis B virus-induced oncogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2007年01期

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本文編號：2290465