【摘要】：背景:目前,肺癌仍然是世界范圍內(nèi)致死率最高的惡性腫瘤,其生物學行為及調(diào)控機制繁復龐雜,現(xiàn)代醫(yī)學遠沒有清楚認識這種極端致命的疾病,因此繼續(xù)深入研究肺癌的發(fā)生、進展機制有重要的科學意義。肺腺癌占肺癌總發(fā)病數(shù)的38.5%,是最常見的肺癌類型。研究表明,76%肺腺癌患者有RTK/RAS/RAF通路的激活型突變,導致下游MAPK通路的持續(xù)激活。由于RTK/RAS/RAF/MAPK通路對肺癌發(fā)生、進展起至關重要的調(diào)控作用,這條肺癌細胞的“生命線”成為分子靶向藥物研究的焦點。然而,盡管針對這條通路上多個分子的靶向治療使一部分患者受益,但是由于耐藥、藥物毒性反應、制藥技術手段的限制等,臨床仍然迫切需要更有效地抑制RTK/RAS/RAF/MAPK通路信號轉(zhuǎn)導的治療手段。另外,有研究表明,許多沒有RTK/RAS/RAF通路突變的肺腺癌患者仍存在MAPK通路的顯著激活,提示未被清楚認知的MAPK通路上游調(diào)控分子的存在。因此,對MAPK通路調(diào)控機制更深入的研究可能為尋找新的治療靶點和策略提供線索。MAP4K4是一種絲/蘇氨酸激酶,由于其對MAPK通路中MAP3K分子的磷酸化作用而得名。MAP4K4作為炎癥反應相關激酶在糖尿病、動脈粥樣硬化等系統(tǒng)性炎癥性疾病中被廣泛研究。MAP4K4對MAPK/JNK、MAPK/ERK、MAPK/p38的調(diào)控作用均可見文獻報道,而其對下游分子的選擇性因生物學系統(tǒng)和疾病進展階段不同而異。MAP4K4在腫瘤發(fā)生、進展中的作用及機制研究較少。有研究表明,MAP4K4在肺腺癌患者腫瘤組織中高表達,且與患者不良預后相關,然而其對肺腺癌細胞功能的調(diào)控作用及機制未見文獻報道。我們推測,MAP4K4可能通過調(diào)控MAPK通路維系肺腺癌細胞的惡性表型,促進肺腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。有研究表明,應用si RNA抑制巨噬細胞MAP4K4的表達能夠有效逆轉(zhuǎn)系統(tǒng)性炎癥,MAP4K4小分子抑制劑能抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生,提示MAP4K4作為分子治療靶點的可能性。深入研究MAP4K4在肺腺癌發(fā)生、進展中的作用及機制可能為肺腺癌治療提供新的抑制MAPK通路的分子靶點,為改進肺腺癌治療策略提供科學依據(jù)。目的:1、研究MAP4K4在肺腺癌患者腫瘤組織中的表達情況,及其與患者EGFR、KRAS突變狀況的相關性。2、研究MAP4K4在體內(nèi)、外對肺腺癌細胞生長、增殖、遷移及侵襲功能的調(diào)控作用。3、初步闡釋MAP4K4調(diào)控肺腺癌細胞功能的分子機制。方法:1、對肺腺癌組織芯片進行MAP4K4免疫組織化學染色,一方面比較腫瘤組織與癌旁組織及正常肺組織MAP4K4表達的差異,一方面結(jié)合患者EGFR、KRAS突變背景,分析MAP4K4在肺腺癌患者腫瘤組織中表達情況與基因突變狀態(tài)的關系。2、應用EGFR突變、KRAS突變及EGFR和KRAS野生型的肺腺癌細胞株作為體外研究的細胞模型,應用sh RNA轉(zhuǎn)染、小分子抑制劑處理及過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法抑制或上調(diào)肺腺癌細胞中MAP4K4的表達,應用MTT細胞增殖實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、劃痕實驗、體外侵襲實驗檢測MAP4K4表達變化對細胞功能的影響;建立裸鼠皮下移植瘤和尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型,體內(nèi)驗證MAP4K4對肺腺癌細胞功能的影響。3、抑制或上調(diào)肺腺癌細胞中MAP4K4的表達后,應用免疫印記技術、RAS活性實驗檢測MAPK通路的分子變化、RAS活性變化,應用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染加回實驗進一步確認MAP4K4對下游分子的調(diào)控作用及其對細胞功能的影響;應用磷酸酶活性實驗檢測肺腺癌細胞中MAP4K4表達改變后MAPK負反饋調(diào)節(jié)通路中磷酸酶的活性。結(jié)果:1、免疫組織化學方法在肺腺癌患者癌旁組織及正常肺組織中檢測不到MAP4K4的表達,在腫瘤組織中MAP4K4高表達,而且其高表達與患者EGFR、KRAS突變情況無關。2、sh RNA或小分子抑制劑抑制各基因背景肺腺癌細胞MAP4K4的表達能夠抑制細胞增殖、軟瓊脂克隆形成、體外遷移和侵襲功能,而且sh RNA抑制MAP4K4表達能夠抑制EGF誘導的H1793(EGFR和KRAS野生型)細胞的增殖。3、MAP4K4通過抑制PP2A活性促進p-ERK1/2的表達,且MAP4K4對ERK1/2的激活作用不依賴于EGFR、RAS、MEK的激活。4、sh RNA抑制MAP4K4的表達能夠顯著抑制肺腺癌細胞在裸鼠體內(nèi)的皮下成瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力,且該作用通過抑制p-ERK1/2的表達而實現(xiàn)。結(jié)論:MAP4K4通過抑制PP2A活性促進ERK1/2的活化,從而促進肺腺癌細胞惡性表型的維系,促進細胞在體內(nèi)的生長、轉(zhuǎn)移,而且這種作用不依賴于EGFR、RAS、MEK的激活,提示MAP4K4可能是新的MAPK/ERK上游調(diào)控分子,且MAP4K4/ERK1/2軸可能是EGFR/KRAS/RAF/MEK/ERK的旁路信號轉(zhuǎn)導途徑,提示MAP4K4可能是肺腺癌新的分子治療靶點。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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本文編號：2266712