發(fā)布時(shí)間：2018-10-12 15:52

【摘要】：背景:目前,肺癌仍然是世界范圍內(nèi)致死率最高的惡性腫瘤,其生物學(xué)行為及調(diào)控機(jī)制繁復(fù)龐雜,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)遠(yuǎn)沒有清楚認(rèn)識(shí)這種極端致命的疾病,因此繼續(xù)深入研究肺癌的發(fā)生、進(jìn)展機(jī)制有重要的科學(xué)意義。肺腺癌占肺癌總發(fā)病數(shù)的38.5%,是最常見的肺癌類型。研究表明,76%肺腺癌患者有RTK/RAS/RAF通路的激活型突變,導(dǎo)致下游MAPK通路的持續(xù)激活。由于RTK/RAS/RAF/MAPK通路對肺癌發(fā)生、進(jìn)展起至關(guān)重要的調(diào)控作用,這條肺癌細(xì)胞的“生命線”成為分子靶向藥物研究的焦點(diǎn)。然而,盡管針對這條通路上多個(gè)分子的靶向治療使一部分患者受益,但是由于耐藥、藥物毒性反應(yīng)、制藥技術(shù)手段的限制等,臨床仍然迫切需要更有效地抑制RTK/RAS/RAF/MAPK通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的治療手段。另外,有研究表明,許多沒有RTK/RAS/RAF通路突變的肺腺癌患者仍存在MAPK通路的顯著激活,提示未被清楚認(rèn)知的MAPK通路上游調(diào)控分子的存在。因此,對MAPK通路調(diào)控機(jī)制更深入的研究可能為尋找新的治療靶點(diǎn)和策略提供線索。MAP4K4是一種絲/蘇氨酸激酶,由于其對MAPK通路中MAP3K分子的磷酸化作用而得名。MAP4K4作為炎癥反應(yīng)相關(guān)激酶在糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等系統(tǒng)性炎癥性疾病中被廣泛研究。MAP4K4對MAPK/JNK、MAPK/ERK、MAPK/p38的調(diào)控作用均可見文獻(xiàn)報(bào)道,而其對下游分子的選擇性因生物學(xué)系統(tǒng)和疾病進(jìn)展階段不同而異。MAP4K4在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中的作用及機(jī)制研究較少。有研究表明,MAP4K4在肺腺癌患者腫瘤組織中高表達(dá),且與患者不良預(yù)后相關(guān),然而其對肺腺癌細(xì)胞功能的調(diào)控作用及機(jī)制未見文獻(xiàn)報(bào)道。我們推測,MAP4K4可能通過調(diào)控MAPK通路維系肺腺癌細(xì)胞的惡性表型,促進(jìn)肺腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。有研究表明,應(yīng)用si RNA抑制巨噬細(xì)胞MAP4K4的表達(dá)能夠有效逆轉(zhuǎn)系統(tǒng)性炎癥,MAP4K4小分子抑制劑能抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,提示MAP4K4作為分子治療靶點(diǎn)的可能性。深入研究MAP4K4在肺腺癌發(fā)生、進(jìn)展中的作用及機(jī)制可能為肺腺癌治療提供新的抑制MAPK通路的分子靶點(diǎn),為改進(jìn)肺腺癌治療策略提供科學(xué)依據(jù)。目的:1、研究MAP4K4在肺腺癌患者腫瘤組織中的表達(dá)情況,及其與患者EGFR、KRAS突變狀況的相關(guān)性。2、研究MAP4K4在體內(nèi)、外對肺腺癌細(xì)胞生長、增殖、遷移及侵襲功能的調(diào)控作用。3、初步闡釋MAP4K4調(diào)控肺腺癌細(xì)胞功能的分子機(jī)制。方法:1、對肺腺癌組織芯片進(jìn)行MAP4K4免疫組織化學(xué)染色,一方面比較腫瘤組織與癌旁組織及正常肺組織MAP4K4表達(dá)的差異,一方面結(jié)合患者EGFR、KRAS突變背景,分析MAP4K4在肺腺癌患者腫瘤組織中表達(dá)情況與基因突變狀態(tài)的關(guān)系。2、應(yīng)用EGFR突變、KRAS突變及EGFR和KRAS野生型的肺腺癌細(xì)胞株作為體外研究的細(xì)胞模型,應(yīng)用sh RNA轉(zhuǎn)染、小分子抑制劑處理及過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法抑制或上調(diào)肺腺癌細(xì)胞中MAP4K4的表達(dá),應(yīng)用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測MAP4K4表達(dá)變化對細(xì)胞功能的影響;建立裸鼠皮下移植瘤和尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型,體內(nèi)驗(yàn)證MAP4K4對肺腺癌細(xì)胞功能的影響。3、抑制或上調(diào)肺腺癌細(xì)胞中MAP4K4的表達(dá)后,應(yīng)用免疫印記技術(shù)、RAS活性實(shí)驗(yàn)檢測MAPK通路的分子變化、RAS活性變化,應(yīng)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染加回實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)MAP4K4對下游分子的調(diào)控作用及其對細(xì)胞功能的影響;應(yīng)用磷酸酶活性實(shí)驗(yàn)檢測肺腺癌細(xì)胞中MAP4K4表達(dá)改變后MAPK負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路中磷酸酶的活性。結(jié)果:1、免疫組織化學(xué)方法在肺腺癌患者癌旁組織及正常肺組織中檢測不到MAP4K4的表達(dá),在腫瘤組織中MAP4K4高表達(dá),而且其高表達(dá)與患者EGFR、KRAS突變情況無關(guān)。2、sh RNA或小分子抑制劑抑制各基因背景肺腺癌細(xì)胞MAP4K4的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖、軟瓊脂克隆形成、體外遷移和侵襲功能,而且sh RNA抑制MAP4K4表達(dá)能夠抑制EGF誘導(dǎo)的H1793(EGFR和KRAS野生型)細(xì)胞的增殖。3、MAP4K4通過抑制PP2A活性促進(jìn)p-ERK1/2的表達(dá),且MAP4K4對ERK1/2的激活作用不依賴于EGFR、RAS、MEK的激活。4、sh RNA抑制MAP4K4的表達(dá)能夠顯著抑制肺腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的皮下成瘤能力和肺轉(zhuǎn)移能力,且該作用通過抑制p-ERK1/2的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。結(jié)論:MAP4K4通過抑制PP2A活性促進(jìn)ERK1/2的活化,從而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞惡性表型的維系,促進(jìn)細(xì)胞在體內(nèi)的生長、轉(zhuǎn)移,而且這種作用不依賴于EGFR、RAS、MEK的激活,提示MAP4K4可能是新的MAPK/ERK上游調(diào)控分子,且MAP4K4/ERK1/2軸可能是EGFR/KRAS/RAF/MEK/ERK的旁路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,提示MAP4K4可能是肺腺癌新的分子治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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本文編號：2266712