發(fā)布時(shí)間：2018-10-12 15:19

【摘要】：結(jié)直腸癌又稱為大腸癌(colorectal cancer,CRC),一種常見的消化道腫瘤。CRC是美國惡性腫瘤的第二位。在我國,CRC居惡性腫瘤的第五位。CRC的預(yù)后與腫瘤的分化程度、是否發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移息息相關(guān),原位癌(I期)的5年生存率超過90%,而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(IV期)時(shí),5年生存率僅約為10%。為此,迫切需要探索更具特異性和敏感性的生物標(biāo)志物,以提高對CRC的篩查和診斷效果,早期診斷、治療CRC。近年來,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展使其在各種惡性腫瘤的研究中也有廣泛應(yīng)用,為進(jìn)一步深入探討腫瘤的發(fā)病機(jī)制、開展腫瘤的個(gè)體化治療提供了一種新的手段。本研究旨在應(yīng)用蛋白組學(xué)的方法研究結(jié)直腸癌腫瘤組織與癌旁組織之間蛋白表達(dá)譜的差異,建立結(jié)直腸癌的差異表達(dá)譜,以期篩選出可用于結(jié)直腸癌輔助診斷的生物標(biāo)記物。在本研究從差異表達(dá)蛋白譜中選取ATP5B作為目標(biāo)蛋白,通過B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體,分析蛋白ATP5B的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。本研究共分為四部分:第一部分:TNMⅢ期結(jié)直腸癌與癌旁組織的差異蛋白譜的建立實(shí)驗(yàn)方法:1.標(biāo)本為20對未接受任何治療的結(jié)直腸腺癌及配對癌旁組織(癌旁組織距癌組織10厘米),且經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為TNMⅢ期腺癌。2.提取標(biāo)本總蛋白,測定蛋白質(zhì)濃度。3.制備蛋白水解多肽混合物。4.二維液相色譜法分離樣本。5.通過LTQXL離子肼質(zhì)譜儀對二維色譜洗脫的多肽進(jìn)行檢測。6.對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,找到癌組織與癌旁組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。結(jié)果:1、經(jīng)分析,腫瘤組織中獲得了蛋白點(diǎn)567個(gè);癌旁組織中蛋白質(zhì)點(diǎn)獲得了434個(gè)。經(jīng)比對,檢索,兩種組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)30個(gè)。2、上調(diào)表達(dá)蛋白(20個(gè)):fbln1、atp5b、tpm4、fga、gstp1、hist1h3j、igha1、serpinh1、tubb3、igha1、tpm3、ckap4、igha2、postn、fgb、fgg、pkm2、hist1h2ae、myh10和tubb。3、下調(diào)表達(dá)蛋白(10個(gè)):synm、myh11、pkm2、krt10、flnc、h2afx、cap1、myl6、tubb2a、tln1。4、從差異表達(dá)蛋白譜中選取atp5b作為目標(biāo)蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。第二部分:atp5b基因擴(kuò)增、載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白實(shí)驗(yàn)方法:1.根據(jù)genbank-nucletide數(shù)據(jù)庫中的atp5b基因序列,擴(kuò)增atp5b目的基因。2.連接atp5b目的基因與pet28a,構(gòu)建原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化bl21細(xì)胞,獲得表達(dá)菌株bl21(de3)(pet28a/atp5b)并誘導(dǎo)表達(dá)。3.超聲破碎菌體,鎳瓊脂糖親和層析純化目的蛋白。4.sds-page檢測純化蛋白。5.westernbloting分析融合蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.成功構(gòu)建pet28a/atp5b(原核表達(dá)質(zhì)粒),經(jīng)dna測序,genbank-nucletide比對,確定為目的序列。2.經(jīng)轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)、純化,sds-page及westernbloting鑒定,獲得純化的目的蛋白。第三部分atp5b單克隆抗體制備、純化、鑒定實(shí)驗(yàn)方法:1.制備atp5b蛋白免疫原,皮下注射免疫小鼠。取免疫小鼠脾臟,制備細(xì)胞,與骨髓瘤細(xì)胞融合。2.HAT選擇性培養(yǎng),ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株;3.陽性雜交瘤細(xì)胞株腹水制備及腹水抗體效價(jià)檢測;4.親和層析法純化腹水中單克隆抗體;5.SDS-PAGE分析純化的單克隆抗體,常染色體染色分析雜交瘤細(xì)胞核型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.得到1株穩(wěn)定分泌抗人ATP5B單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;2.抗體效價(jià)達(dá)1:240000,抗體純度達(dá)95%以上。第四部分ATP5B在組織中的差異表達(dá)及臨床病理參數(shù)分析實(shí)驗(yàn)方法:1.收集30對結(jié)直腸癌組織及癌旁組織;2.根據(jù)病理診斷TNM分期將臨床病理資料分組;3.免疫組化法檢測ATP5B在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá),并分析ATP5B表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床參數(shù)的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.通過免疫組化觀察到結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中均可檢測到ATP5B陽性表達(dá),結(jié)直腸癌組織中表達(dá)率水平顯著高于癌旁組織。2.ATP5B蛋白陽性表達(dá)率與結(jié)直腸癌的腫瘤分化水平及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān):在腫瘤伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中ATP5B蛋白陽性表達(dá)率較高。通過以上研究,我們得出以下結(jié)論:1.本研究成功建立了結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的差異蛋白譜。2.成功建立了ATP5B蛋白的雜交瘤細(xì)胞株,并進(jìn)行了純化與鑒定;同時(shí)制備了ATP5B蛋白的單克隆抗體,為后續(xù)ATP5B蛋白功能的研究及單抗的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。3.驗(yàn)證了結(jié)直腸癌組織中ATP5B的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。4.證實(shí)了ATP5B蛋白與結(jié)直腸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,為判斷結(jié)直腸癌疾病的發(fā)展提供了潛在的依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

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本文編號：2266620