【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康南佘账峄罨鞍准っ赶嚓P(guān)激酶5(ARK5)在包括肝細(xì)胞肝癌(HCC)在內(nèi)的多種腫瘤內(nèi)均高表達(dá)。腫瘤細(xì)胞內(nèi)ARK5高表達(dá)的病人的預(yù)后較差。ARK5可以促進(jìn)腫瘤的增殖,侵襲,遷移,復(fù)發(fā),但是其與腫瘤耐藥性的關(guān)系尚不清楚。本研究的目的就是觀察ARK5在肝癌對(duì)多柔比星耐藥性中的作用及其內(nèi)在機(jī)制。材料與方法本研究通過多柔比星處理Huh7, Hep3B, SNU449和SNU387四種肝癌細(xì)胞系,利用細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞活力,蛋白免疫印跡技術(shù)(Western-blot)、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ARK5、上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(EdU試驗(yàn))檢測(cè)肝癌細(xì)胞系的增殖情況。ARK5 siRNA干擾肝癌細(xì)胞系內(nèi)ARK5的表達(dá),觀察Huh7, Hep3B, SNU387, SNU449四種細(xì)胞系的細(xì)胞活力、增殖情況以及細(xì)胞內(nèi)上皮間質(zhì)化相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。為探討ARKS影響肝癌耐藥的機(jī)制,我們首先利用多柔比星處理肝癌細(xì)胞系,再用ARK5 siRNA干擾肝癌細(xì)胞系內(nèi)ARK5的表達(dá),Wetern-blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)；利用TWIST SiRNA干擾肝癌細(xì)胞系內(nèi)TWIST的表達(dá),再分別給予多柔比星和多柔比星KARK5 siRNA處理肝癌細(xì)胞系,并檢測(cè)Huh7, Hep3B, SNU387, SNU449四種細(xì)胞系對(duì)多柔比星的敏感性。為了明確ARK5在低氧誘導(dǎo)的MT的作用,ARK5 siRNA處理的低氧條件培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系Huh7、Hep3B,并檢測(cè)其細(xì)胞活力、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白。結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)ARK5的表達(dá)與肝癌細(xì)胞系對(duì)多柔比星的敏感性呈負(fù)相關(guān)；(2)ARK5敲除后可顯著增加肝癌細(xì)胞系對(duì)多柔比星的敏感性；(3)ARK5可調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)；(4)干擾多柔比星處理后的肝癌細(xì)胞系中ARK5的表達(dá),可以逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系的EMT；(5)ARK5通過TWSIT通路調(diào)控肝癌細(xì)胞系對(duì)多柔比星的耐藥性；(6)干擾低氧狀態(tài)下培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系內(nèi)ARK5的表達(dá),可以逆轉(zhuǎn)低氧誘導(dǎo)的EMT。結(jié)論：ARK5的高表達(dá)可明顯降低肝癌細(xì)胞系對(duì)多柔比星的敏感性,抑制肝癌細(xì)胞系內(nèi)ARK5的表達(dá)不僅可以顯著增加肝癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性,還能逆轉(zhuǎn)多柔比星和低氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥性。ARK5影響肝癌對(duì)多柔比星耐藥性機(jī)制為ARK5的低表達(dá)抑制TWIST通路,引起E-cadherin的表達(dá)上調(diào)和Vimentin的表達(dá)下調(diào),從而抑制肝癌細(xì)胞系的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
[Abstract]:Objective adenylate activated protein kinase associated kinase 5 (ARK5) was overexpressed in various tumors including hepatocellular carcinoma (HCC) (HCC). The prognosis of patients with high expression of ARK5 in tumor cells is poor. ARK5 can promote the proliferation, invasion, migration and recurrence of tumor, but the relationship between ARK5 and tumor resistance is not clear. The aim of this study was to investigate the role and mechanism of ARK5 in the resistance of hepatocellular carcinoma to doxorubicin. Materials and methods in this study, Huh7, Hep3B, SNU449 and SNU387 hepatoma cell lines were treated with doxorubicin, and cell viability was detected by cell viability test kit (CCK-8). Western blotting (Western-blot) and immunofluorescence technique were used to detect the expression of transforming proteins in the epithelial stromal cells of ARK5,. Cell proliferation test kit (EdU test) was used to detect the proliferation of HCC cell lines. ARK5 siRNA interfered with the expression of ARK5 in HCC cell lines and observed the cell viability of four Huh7, Hep3B, SNU387, SNU449 cell lines. Proliferation and expression of epithelial interstitial associated proteins in cells. In order to investigate the mechanism of ARKS affecting drug resistance of HCC, we first treated HCC cell line with doxorubicin, then used ARK5 siRNA to interfere the expression of ARK5 in HCC cell line, detected the expression of EMT related protein by Wetern-blot, and used TWIST SiRNA to interfere the expression of TWIST in HCC cell line. The hepatoma cell lines were treated with doxorubicin and doxorubicin KARK5 siRNA, respectively, and the sensitivity of four Huh7, Hep3B, SNU387, SNU449 cell lines to doxorubicin was detected. In order to elucidate the role of ARK5 in hypoxia induced MT, ARK5 siRNA treated hepatoma cell line Huh7,Hep3B, was cultured under hypoxia condition, and its cell viability and epithelial interstitial transformation associated protein were detected. Results the results showed that: (1) the expression of ARK5 was negatively correlated with the sensitivity of hepatoma cell line to doxorubicin, (2) ARK5 knockout could significantly increase the sensitivity of hepatoma cell line to doxorubicin, (3) ARK5 could regulate the expression of EMT related protein. (4) interfering with the expression of ARK5 in hepatoma cell line treated with doxorubicin could reverse the resistance of EMT; (5) ARK5 to doxorubicin through TWSIT pathway. (6) interfering with the expression of ARK5 in hepatoma cell line cultured under hypoxia can reverse the hypoxia induced EMT.. Conclusion: the high expression of ARK5 can significantly decrease the sensitivity of hepatoma cell line to doxorubicin, and inhibit the expression of ARK5 in hepatoma cell line can not only increase the sensitivity of hepatoma cell line to doxorubicin, but also increase the sensitivity of hepatoma cell line to doxorubicin. In addition, doxorubicin and hypoxia induced drug resistance of hepatoma cells to doxorubicin were reversed. The mechanism of ARK5 affecting drug resistance of HCC to doxorubicin was that the low expression of ARK5 inhibited the TWIST pathway, which resulted in the up-regulation of E-cadherin expression and the down-regulation of Vimentin expression. Thus inhibiting the epithelial mesenchymal transformation of hepatoma cell lines.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2266829