【摘要】：目的:腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡主要原因之一。淋巴道轉(zhuǎn)移多先于血道轉(zhuǎn)移,是最為常見的轉(zhuǎn)移方式。乳腺癌在女性惡性腫瘤中發(fā)病率居高位,淋巴道轉(zhuǎn)移是乳腺癌主要轉(zhuǎn)移途徑。淋巴管新生是淋巴道轉(zhuǎn)移的重要過程,包括淋巴管內(nèi)皮細胞的增殖,遷移及管樣結(jié)構(gòu)的形成。在腫瘤轉(zhuǎn)移中,腫瘤微環(huán)境的腫瘤細胞,間質(zhì)細胞等協(xié)同作用,通過分泌促淋巴管生成因子誘導淋巴管生成。抑制腫瘤誘導的淋巴管新生,從而抑制腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移成為新的靶點。巖藻黃素(fucoxanthin)主要來源于褐藻(如裙帶菜Undaria pinnatifida等),屬脂溶性類胡蘿卜素,具有抗腫瘤、抗氧化、分解脂肪等多種藥理活性,是極具應用潛力的海洋植物藥源物質(zhì)。血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)是淋巴管特異性標志物,其與血管內(nèi)皮細胞生長因子受體3(VEGFR3)為淋巴管新生的主要調(diào)節(jié)因子,它們的激活可誘導淋巴管內(nèi)皮細胞(LECs)的增殖和遷移,促進淋巴管新生。PI3K/Akt/NF-кB信號通路主要促進細胞增殖,轉(zhuǎn)移,激活通路上的靶蛋白,能促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究從裙帶菜中提取fucoxanthin,以人淋巴內(nèi)皮細胞系HLEC為研究對象,采用細胞生物學、分子生物學及動物腫瘤模型,研究fucoxanthin對腫瘤誘導淋巴管新生的抑制作用,并探究其可能的機制。方法:1.MTT法檢測fucoxanthin對HLEC細胞生長活力的影響,并采用流式細胞術(shù)檢測fucoxanthin對HLEC細胞周期的影響。2.Transwell法檢測fucoxanthin對HLEC細胞遷移能力的變化,且采用細胞骨架染色法檢測fucoxanthin對HLEC細胞骨架結(jié)構(gòu)的影響。3.采用體外實驗檢測fucoxanthin對HLEC管腔形成能力的影響。RT-PCR方法檢測fucoxanthin對HLEC細胞中VEGF-C和VEGFR3 m RNA表達的影響,并采用western blot檢測VEGFR3及VEGF-C蛋白水平變化;采用ELISA法檢測fucoxanthin對p-VEGFR-3表達的影響(http://www.immunoway.com)。4.Western blot檢測fucoxanthin對HLEC中NF-кB/PI3K/Akt信號通路的影響。5.MTT法檢測fucoxanthin對MDA-MB-231細胞生長活力的影響6.Transwell法檢測fucoxanthin對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響7.Transwell、ELISA、western blot方法檢測fucoxanthin對MDA-MB-231細胞侵襲能力及MMP-2,MMP-9,TIMP-1表達水平的影響8.ELISA、RT-PCR方法檢測fucoxanthin對MDA-MB-231細胞VEGF-C分泌及m RNA水平的影響9.條件培養(yǎng)體系下,MTT、Transwell、成管、ELISA等方法檢測條件培養(yǎng)下,HLEC細胞活力,遷移及淋巴管狀結(jié)構(gòu)形成及p-VEGFR-3表達的變化。10.采用MDA-MB-231細胞株建立裸鼠腫瘤模型,以裸鼠腫瘤組織為對象,雙標免疫熒光法檢測fucoxanthin對淋巴管密度(LVD)的影響。結(jié)果:1.MTT法檢測結(jié)果顯示fucoxanthin抑制HLEC細胞活力。流式細胞術(shù)結(jié)果表明,fucoxanthin阻滯HLEC細胞S期,從而抑制HLEC的增殖能力。2.Transwell法檢測結(jié)果顯示fucoxanthin誘導HLEC細胞遷移能力降低。骨架蛋白熒光實驗表明,fucoxanthin處理下,細胞形態(tài)稍皺縮,偽足不明顯,極性減弱。結(jié)果說明,fucoxanthin可以影響細胞骨架結(jié)構(gòu),從而使細胞運動能力下降。3.成管實驗結(jié)果顯示,fucoxanthin對HLEC細胞管狀結(jié)構(gòu)的形成具有抑制作用,呈劑量依賴性關(guān)系。RT-PCR和WB實驗結(jié)果表明fucoxanthin抑制VEGF-C和VEGFR3蛋白和m RNA表達。ELISA實驗結(jié)果表明fucoxanthin顯著抑制p-VEGFR-3的表達。4.Western blot結(jié)果顯示fucoxanthin處理組中p-PI3K,p-Akt和NF-κB蛋白表達下調(diào)。5.MTT法檢測結(jié)果顯示fucoxanthin抑制MDA-MB-231細胞活力。6.Transwell法檢測結(jié)果表明fucoxanthin抑制MDA-MB-231細胞遷移能力。7.Transwell、ELISA、western blot方法檢測結(jié)果顯示fucoxanthin抑制MDA-MB-231細胞侵襲能力,同時MMP-2,MMP-9下調(diào),TIMP-1表達上調(diào)。8.ELISA、RT-PCR方法檢測結(jié)果顯示fucoxanthin對MDA-MB-231細胞VEGF-C分泌量及m RNA表達均有明顯抑制作用。9.條件培養(yǎng)體系下,MTT、Transwell、成管、ELISA等方法檢測結(jié)果顯示HLEC細胞活力,遷移及淋巴管樣結(jié)構(gòu)形成能力均在fucoxanthin處理下顯著抑制,p-VEGFR-3表達顯著降低。10.動物模型實驗表明fucoxanthin能夠抑制體內(nèi)腫瘤淋巴管新生。結(jié)論:Fucoxanthin抑制HLEC的增殖、遷移及腫瘤誘導的淋巴管新生。Fucoxanthin通過調(diào)控VEGF-C的表達和分泌,鈍化PI3K/Akt/NF-кB信號通路,從而抑制腫瘤誘導的淋巴管新生及淋巴道轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5

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本文編號：2259277