【摘要】：目的:腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡主要原因之一。淋巴道轉(zhuǎn)移多先于血道轉(zhuǎn)移,是最為常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式。乳腺癌在女性惡性腫瘤中發(fā)病率居高位,淋巴道轉(zhuǎn)移是乳腺癌主要轉(zhuǎn)移途徑。淋巴管新生是淋巴道轉(zhuǎn)移的重要過(guò)程,包括淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,遷移及管樣結(jié)構(gòu)的形成。在腫瘤轉(zhuǎn)移中,腫瘤微環(huán)境的腫瘤細(xì)胞,間質(zhì)細(xì)胞等協(xié)同作用,通過(guò)分泌促淋巴管生成因子誘導(dǎo)淋巴管生成。抑制腫瘤誘導(dǎo)的淋巴管新生,從而抑制腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移成為新的靶點(diǎn)。巖藻黃素(fucoxanthin)主要來(lái)源于褐藻(如裙帶菜Undaria pinnatifida等),屬脂溶性類胡蘿卜素,具有抗腫瘤、抗氧化、分解脂肪等多種藥理活性,是極具應(yīng)用潛力的海洋植物藥源物質(zhì)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF-C)是淋巴管特異性標(biāo)志物,其與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(VEGFR3)為淋巴管新生的主要調(diào)節(jié)因子,它們的激活可誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(LECs)的增殖和遷移,促進(jìn)淋巴管新生。PI3K/Akt/NF-кB信號(hào)通路主要促進(jìn)細(xì)胞增殖,轉(zhuǎn)移,激活通路上的靶蛋白,能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究從裙帶菜中提取fucoxanthin,以人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞系HLEC為研究對(duì)象,采用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)及動(dòng)物腫瘤模型,研究fucoxanthin對(duì)腫瘤誘導(dǎo)淋巴管新生的抑制作用,并探究其可能的機(jī)制。方法:1.MTT法檢測(cè)fucoxanthin對(duì)HLEC細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響,并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)fucoxanthin對(duì)HLEC細(xì)胞周期的影響。2.Transwell法檢測(cè)fucoxanthin對(duì)HLEC細(xì)胞遷移能力的變化,且采用細(xì)胞骨架染色法檢測(cè)fucoxanthin對(duì)HLEC細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響。3.采用體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)fucoxanthin對(duì)HLEC管腔形成能力的影響。RT-PCR方法檢測(cè)fucoxanthin對(duì)HLEC細(xì)胞中VEGF-C和VEGFR3 m RNA表達(dá)的影響,并采用western blot檢測(cè)VEGFR3及VEGF-C蛋白水平變化;采用ELISA法檢測(cè)fucoxanthin對(duì)p-VEGFR-3表達(dá)的影響(http://www.immunoway.com)。4.Western blot檢測(cè)fucoxanthin對(duì)HLEC中NF-кB/PI3K/Akt信號(hào)通路的影響。5.MTT法檢測(cè)fucoxanthin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響6.Transwell法檢測(cè)fucoxanthin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響7.Transwell、ELISA、western blot方法檢測(cè)fucoxanthin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力及MMP-2,MMP-9,TIMP-1表達(dá)水平的影響8.ELISA、RT-PCR方法檢測(cè)fucoxanthin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞VEGF-C分泌及m RNA水平的影響9.條件培養(yǎng)體系下,MTT、Transwell、成管、ELISA等方法檢測(cè)條件培養(yǎng)下,HLEC細(xì)胞活力,遷移及淋巴管狀結(jié)構(gòu)形成及p-VEGFR-3表達(dá)的變化。10.采用MDA-MB-231細(xì)胞株建立裸鼠腫瘤模型,以裸鼠腫瘤組織為對(duì)象,雙標(biāo)免疫熒光法檢測(cè)fucoxanthin對(duì)淋巴管密度(LVD)的影響。結(jié)果:1.MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示fucoxanthin抑制HLEC細(xì)胞活力。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,fucoxanthin阻滯HLEC細(xì)胞S期,從而抑制HLEC的增殖能力。2.Transwell法檢測(cè)結(jié)果顯示fucoxanthin誘導(dǎo)HLEC細(xì)胞遷移能力降低。骨架蛋白熒光實(shí)驗(yàn)表明,fucoxanthin處理下,細(xì)胞形態(tài)稍皺縮,偽足不明顯,極性減弱。結(jié)果說(shuō)明,fucoxanthin可以影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),從而使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力下降。3.成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,fucoxanthin對(duì)HLEC細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)的形成具有抑制作用,呈劑量依賴性關(guān)系。RT-PCR和WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明fucoxanthin抑制VEGF-C和VEGFR3蛋白和m RNA表達(dá)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明fucoxanthin顯著抑制p-VEGFR-3的表達(dá)。4.Western blot結(jié)果顯示fucoxanthin處理組中p-PI3K,p-Akt和NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)。5.MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示fucoxanthin抑制MDA-MB-231細(xì)胞活力。6.Transwell法檢測(cè)結(jié)果表明fucoxanthin抑制MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力。7.Transwell、ELISA、western blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示fucoxanthin抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力,同時(shí)MMP-2,MMP-9下調(diào),TIMP-1表達(dá)上調(diào)。8.ELISA、RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示fucoxanthin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞VEGF-C分泌量及m RNA表達(dá)均有明顯抑制作用。9.條件培養(yǎng)體系下,MTT、Transwell、成管、ELISA等方法檢測(cè)結(jié)果顯示HLEC細(xì)胞活力,遷移及淋巴管樣結(jié)構(gòu)形成能力均在fucoxanthin處理下顯著抑制,p-VEGFR-3表達(dá)顯著降低。10.動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明fucoxanthin能夠抑制體內(nèi)腫瘤淋巴管新生。結(jié)論:Fucoxanthin抑制HLEC的增殖、遷移及腫瘤誘導(dǎo)的淋巴管新生。Fucoxanthin通過(guò)調(diào)控VEGF-C的表達(dá)和分泌,鈍化PI3K/Akt/NF-кB信號(hào)通路,從而抑制腫瘤誘導(dǎo)的淋巴管新生及淋巴道轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R730.5

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本文編號(hào)：2259277