發(fā)布時(shí)間：2018-10-09 11:25

【摘要】：背景:肺癌的發(fā)病率和死亡率在我國以及世界其它地區(qū)的腫瘤性疾病中均排名第一位,已成為目前嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤之一。相比其他的惡性腫瘤,肺癌具有發(fā)病率高、死亡率高、不易早期診斷、早期治療以及治療手段少等特點(diǎn),因此目前肺癌患者的5年存活率仍不到15%。近年來的大量研究表明,深入研究肺癌的發(fā)生機(jī)制,尋找有效的生物標(biāo)志物用于肺癌的早期診斷是降低肺癌死亡率的重要策略之一。肺癌發(fā)生除了與遺傳學(xué)異常改變相關(guān)外,表觀遺傳學(xué)改變在其中的作用越來越受到重視,尤其是DNA甲基化調(diào)控在肺癌的發(fā)生過程中的作用與機(jī)制的研究最為深入,其中抑癌基因通過高甲基化失活廣泛參與了肺癌的發(fā)生而被認(rèn)為是較好的肺癌診斷標(biāo)志物。我們前期通過全基因組篩選新發(fā)現(xiàn)一個(gè)在肺癌中高甲基化的基因TMEM196基因,通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn),目前國內(nèi)外還未見關(guān)于TMEM196基因甲基化在肺癌發(fā)生機(jī)制中的研究報(bào)道,而根據(jù)我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測TMEM196基因在腫瘤發(fā)生過程中可通過高甲基化而失活,是一個(gè)候選的抑癌基因,因此有必要通過臨床肺癌組織標(biāo)本進(jìn)一步證實(shí)該基因在肺癌中甲基化的變化和解析該基因在腫瘤發(fā)生過程中的作用和功能,為其在臨床診斷、治療以及在其他疾病發(fā)生中的作用提供資料。目的:(1)明確TMEM196基因在肺癌細(xì)胞和肺癌組織的甲基化發(fā)生情況以及與患者臨床病理資料之間的關(guān)系;(2)明確TMEM196基因甲基化對(duì)其表達(dá)的影響及調(diào)控;(3)分析明確TMEM196基因在肺癌組織的蛋白表達(dá)與患者臨床病理資料和預(yù)后之間的關(guān)系;(4)初步分析TMEM196基因在腫瘤發(fā)生中的作用。實(shí)驗(yàn)方法:(1)采用甲基化特異性PCR結(jié)合亞硫酸氫鹽修飾測序BSP方法分析檢測肺癌細(xì)胞和肺癌組織中TMEM196基因的甲基化發(fā)生情況;(2)采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)和免疫組織化學(xué)染色的方法檢測肺癌細(xì)胞、肺癌組織和癌旁組織中tmem196基因的表達(dá)情況以及去甲基化藥物5-aza-dc處理前后肺癌細(xì)胞中tmem196基因的表達(dá)變化情況;(3)構(gòu)建tmem196基因高表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞模型,利用cck-8和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法,初步分析該基因在腫瘤發(fā)生過程中的功能;(4)采用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件,通過卡方檢驗(yàn)分析tmem196基因甲基化或表達(dá)與患者臨床病理資料之間的相關(guān)性,通過kaplan-meier和cox-regression生存分析方法分析tmem196基因表達(dá)與患者生存時(shí)間之間的關(guān)聯(lián)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)tmem196基因在10例肺癌腫瘤細(xì)胞中均可檢測出甲基化,而在正常肺上皮細(xì)胞hbe細(xì)胞中未檢測出甲基化。在肺癌腫瘤組織中其甲基化檢出率為61.2%(52/85),而在20例正常肺組織中該基因均未發(fā)生甲基化,甲基化發(fā)生率為0%,提示tmem196基因甲基化與肺癌的發(fā)生明顯相關(guān);(2)tmem196基因甲基化與性別、吸煙史、年齡及肺癌病理分型無明顯相關(guān)性(p0.05),但與腫瘤臨床分期以及分化程度密切相關(guān),隨著腫瘤分化程度降低,tmem196基因甲基化發(fā)生率逐漸升高(p=0.012),在iii期和iv期肺癌患者中tmem196基因甲基化率顯著高于i期和ii期患者(p=0.007),提示其甲基化是一個(gè)候選的診斷標(biāo)志物;(3)tmem196基因在9例發(fā)生甲基化的肺癌細(xì)胞中均出現(xiàn)表達(dá)缺失或下降,而在正常肺組織中表達(dá)正常,同時(shí)在發(fā)生甲基化的肺癌組織中的表達(dá)也明顯下降,而在沒有發(fā)生甲基化的癌旁組織中的表達(dá)較高,表明tmem196基因在肺癌組織中的甲基化也與其表達(dá)相關(guān)。去甲基化實(shí)驗(yàn)證實(shí)tmem196基因直接負(fù)調(diào)控其表達(dá);(4)kaplan-meier單因素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),tmem196蛋白高表達(dá)的肺癌患者生存時(shí)間更長(p0.001)。但在臨床i+ii期肺癌患者中,tmem196蛋白高表達(dá)患者的生存時(shí)間長,而在臨床iii+iv期患者中tmem196蛋白表達(dá)與患者預(yù)后沒有顯著差別。cox-regression進(jìn)行了多因素校正分析發(fā)現(xiàn),tmem196基因蛋白表達(dá)是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子(p=0.0003);(5)構(gòu)建了tmem196高表達(dá)的細(xì)胞模型,利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)均證實(shí)tmem196高表達(dá)可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖和克隆形成;而利用rna干擾tmem196基因的表達(dá)后,腫瘤細(xì)胞增殖達(dá)到恢復(fù),這表明在體外tmem196基因可以抑制腫瘤細(xì)胞生長,是一個(gè)候選的抑癌基因。結(jié)論:(1)TMEM196基因的甲基化在肺癌組織和肺癌細(xì)胞中普遍發(fā)生,而在正常肺組織中未檢測到甲基化發(fā)生,它們的甲基化發(fā)生率存在明顯差別,表明TMEM196基因甲基化與肺癌發(fā)生密切相關(guān);(2)TMEM196基因甲基化發(fā)生率隨著腫瘤分化程度降低而逐漸升高,在III期和IV期肺癌患者中TMEM196基因甲基化率顯著高于I期和II期患者,是一個(gè)候選的診斷標(biāo)志物;(3)TMEM196基因甲基化直接負(fù)調(diào)控其表達(dá)。在腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞中,TMEM196基因表達(dá)明顯下調(diào)或者不表達(dá),同時(shí)TMEM196蛋白高表達(dá)有利于肺癌患者的預(yù)后,是肺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素;(4)TMEM196基因在體外能明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖,是一個(gè)候選的抑癌基因。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

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1 趙歡;TMEM196基因在肺癌中甲基化及功能的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：2259172