【摘要】：肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上發(fā)病率僅次于胃癌和食道癌的第三大常見惡性腫瘤,嚴重威脅人類健康。但目前臨床上缺乏有效的治療手段,盡管樹突狀細胞(Dendritic Cell,DC)為基礎(chǔ)的免疫治療在臨床上表現(xiàn)出一定的治療效果,但治療效果極為有限;并且DC疫苗作為一種細胞疫苗,存在著貨架期短和對病人來源細胞要求高等局限性。近年來,exosome作為細胞分泌的一種膜性生物納米囊泡結(jié)構(gòu),受到腫瘤免疫領(lǐng)域的關(guān)注。特別是DC來源的exosomes(DEX)攜帶大量的源細胞功能蛋白,包括MHC-I/II類分子及CD80、CD86、intercellular adhesion molecule(ICAM)等免疫協(xié)同刺激因子,可以作為DC取代物,直接激活初始T細胞,誘導(dǎo)毒性T淋巴細胞產(chǎn)生,發(fā)揮抑癌效果;而且DEX在-80°C下可保存6個月,貨架期較長�；贒EX獨特的優(yōu)勢,已有報道發(fā)現(xiàn),負載了腫瘤抗原短肽的DEX在體內(nèi)可激活腫瘤抗原特異性CTL,發(fā)揮顯著的抗腫瘤效果,但是DEX在肝細胞癌免疫治療中治療效果有待研究。因此,本研究旨在利用不同的肝細胞癌體外和體內(nèi)模型,通過系統(tǒng)測試負載肝癌特異性抗原甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的DEX_(AFP)在不同肝細胞癌小鼠模型體內(nèi)的抗腫瘤效果,以確定DEX_(AFP)在肝細胞癌免疫治療中的治療效果和潛力,并探討DEX_(AFP)為基礎(chǔ)的免疫治療潛在的作用機制。首先,我們將表達AFP蛋白的慢病毒載體轉(zhuǎn)染DC2.4細胞株(以下簡稱DC),以獲得AFP穩(wěn)定表達的樹突狀細胞系DC_(AFP),通過流式檢測確定DC_(AFP)細胞表面主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I/MHC-II)和協(xié)同刺激因子CD80、CD86和ICAM等表達水平顯著高于正常DC;并在肝細胞癌皮下瘤模型上確認了DC_(AFP)的肝癌抑制效果。對DC_(AFP)分泌的exosomes(DEX_(AFP)),進行流式檢測發(fā)現(xiàn),與正常DC來源的DEX相比,DEX_(AFP)富集更多的MHC-I、MHC-II、CD80、CD86和ICAM分子,表明DEX_(AFP)具有一定的免疫原性。為了測試DEX_(AFP)在體內(nèi)的抗原特異性,我們將DEX_(AFP)免疫小鼠來源的脾臟細胞分別用DEX和DEX_(AFP)在體外再刺激,并將刺激后的T細胞分別與不同的腫瘤細胞(肝癌細胞Hepa1-6,H22,肺癌LLC1,胰腺癌Panc02)共孵育。結(jié)果表明:只有經(jīng)DEX_(AFP)免疫過的小鼠來源脾臟T細胞可以在體外被DEX_(AFP)進一步活化,并且這些被活化的T細胞只對AFP特異性表達的小鼠肝癌細胞系Hepa1-6具有殺傷效應(yīng),顯示了DEX_(AFP)的抗原特異性殺傷作用。為了進一步探究DEX_(AFP)在體內(nèi)的抗腫瘤效果,我們選擇了小鼠皮下瘤模型對DEX_(AFP)的治療策略進行了優(yōu)化研究。通過對皮下注射(s.c.)和尾靜脈注射(i.v)兩種注射方式的治療效果和生存期比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn):盡管兩者間并無顯著性差異,但尾靜脈注射組治療效果稍優(yōu)于皮下注射組,因此在后續(xù)試驗中,我們選擇尾靜脈注射作為主要給藥方式。進一步對不同治療周期的優(yōu)化試驗中發(fā)現(xiàn),多次免疫治療效果明顯優(yōu)于單次,特別是每周一次,連續(xù)免疫三次治療效果較佳,因此在后續(xù)試驗中選擇三次治療(1次/周)作為主要給藥周期。為確定治療的最佳劑量,我們分別在肝細胞癌皮下瘤模型上,測試三種不同劑量,通過對不同的DEX_(AFP)治療劑量比較后,確定單次劑量40μg/鼠為DEX_(AFP)在皮下瘤模型上的最低有效劑量。盡管肝細胞癌皮下瘤模型作為給藥方式、周期和劑量優(yōu)化的有效模型,但不能完全反映肝細胞癌的免疫和腫瘤微環(huán)境,而原位肝細胞癌模型則能更好地反映臨床肝癌病人的免疫和腫瘤微環(huán)境。為了測試DEX_(AFP)對于原位肝細胞癌的治療潛力和效果,我們在移植型原位肝癌模型上對DEX_(AFP)治療效果進行了系統(tǒng)的測試研究。首先,我們對荷瘤7天的原位移植瘤小鼠分別進行了每周1次,連續(xù)3周和每5天用藥1次,連續(xù)用藥4次的給藥周期比較。對其治療效果的分析,發(fā)現(xiàn)兩種給藥方式均能顯著抑制腫瘤生長,并延長荷瘤小鼠的生存期;但相較而言,連續(xù)用藥3周后,DEX_(AFP)略優(yōu)于連續(xù)用藥4次,每5天用藥1次的治療效果。因此在后續(xù)試驗中,我們選擇每周1次,連續(xù)3周的給藥方式,并在這一給藥模式下,探討了DEX_(AFP)的抑制腫瘤效果與免疫微環(huán)境改善之間的相關(guān)性。通過比較不同治療時間點,DEX_(AFP)對原位肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長情況及相對應(yīng)的免疫細胞和免疫因子水平變化;結(jié)果表明:DEX_(AFP)對小鼠原位瘤表現(xiàn)為持續(xù)性抑制生長作用;隨著治療次數(shù)的增加,DEX_(AFP)對免疫微環(huán)境的改善也表現(xiàn)為逐漸增強,特別是在2次和第3次治療之間,治療小鼠的免疫微環(huán)境改善最為顯著,說明DEX_(AFP)對原位肝癌的治療效果具有累計效應(yīng)。為了更好地模擬臨床肝癌病人病理上的異質(zhì)性和復(fù)雜性及抑制性免疫微環(huán)境,同時更為全面地評價DEX_(AFP)的臨床適用性。我們利用化學藥物二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DENA)誘導(dǎo)法成功地建立了原發(fā)性小鼠肝癌模型。通過對原發(fā)性小鼠肝癌模型病理和免疫微環(huán)境的檢測,確立了該模型的病理復(fù)雜性和異質(zhì)性以及抑制性免疫微環(huán)境。在DENA誘導(dǎo)后7個月,在小鼠肝臟可見清晰腫瘤病灶,并檢測到抑制性免疫微環(huán)境,證明原發(fā)性肝癌小鼠模型的成功建立。因此,DEX_(AFP)治療試驗從第8個月開始,進行每周一次,為期3周的治療周期。在最后一次治療后10周收樣。通過對治療小鼠肝臟腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量、重量和大小及體積的測量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與PBS和DEX組相比,DEX_(AFP)能夠明顯減少小鼠腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量、體積以及肝臟的代償性增生,表現(xiàn)出顯著的地抑瘤效果。為了闡明DEX_(AFP)對原發(fā)性HCC免疫和腫瘤微環(huán)境的影響,我們分別檢測小鼠免疫微環(huán)境和腫瘤微環(huán)境相應(yīng)指標,結(jié)果發(fā)現(xiàn):DEX_(AFP)治療組外周血中功能CD8~+T細胞的比例和促進腫瘤免疫因子分泌水平顯著升高,而抑制性Treg細胞的比例以及抑制性腫瘤免疫因子分泌水平顯著下降,說明DEX_(AFP)顯著改善治療小鼠免疫微環(huán)境。對相應(yīng)腫瘤組織中T細胞數(shù)量和免疫因子水平的檢測,發(fā)現(xiàn)DEX_(AFP)治療組腫瘤組織中,CD8~+T細胞以及CD3~+T細胞浸潤比例顯著增加,而抑制性Treg細胞的聚集和抑制性免疫因子分泌顯著下調(diào)。這些結(jié)果說明:DEX_(AFP)對原發(fā)性肝細胞癌具有顯著抑瘤作用,并且能夠改善原發(fā)性肝癌免疫和腫瘤微環(huán)境。為了闡明DEX_(AFP)抗腫瘤作用機制,我們利用胸腺缺陷的免疫缺陷型小鼠,通過檢測DEX_(AFP)對T細胞缺失的免疫缺陷型裸鼠的腫瘤生長抑制效果和生存期作用,確認T細胞在DEX_(AFP)介導(dǎo)的抗腫瘤中的重要作用。同時,對NK細胞的檢測,表明NK細胞可能在DEX_(AFP)介導(dǎo)的抗腫瘤過程中也起到一定作用。結(jié)論:表達肝癌特異性抗原的exosome對肝細胞癌表現(xiàn)為高效的抑瘤作用,并改善肝細胞癌免疫和腫瘤微環(huán)境,可以作為肝細胞癌免疫治療的非細胞疫苗。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：2256914