【摘要】：全球范圍來(lái)說(shuō),肺癌是最常見的惡性腫瘤之一。在肺癌類型中,大約85%左右的都是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。目前,肺癌的治療方式一般有手術(shù)切除,放療,化療,但是這些常見的治療手段并沒(méi)有顯著性地延長(zhǎng)肺癌病人的生存周期。分子靶向治療是近年肺癌治療上的重大突破。針對(duì)NSCLC有效的藥物主要是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors,TKI),還有針對(duì)棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4 (EML4) /間變淋巴瘤激酶(ALK)融合基因EML4-ALK突變的藥物,還有其他分子靶向藥物。分子靶向藥物的治療效果很好,但是肺癌病人在用藥1年左右往往會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。而且最近引入的腫瘤免疫療法,例如免疫檢查點(diǎn)抑制劑CTLA-4抗體,PD-1抗體,PD-L1抗體對(duì)部分病人有效,對(duì)另外一部分病人則無(wú)應(yīng)答。所以免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效還有待進(jìn)一步的提高。因此,肺癌治療仍然需要新的治療方案。嵌合型抗原受體基因修飾的T細(xì)胞(CART)作為腫瘤靶向免疫治療,在體外和臨床實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出良好的靶向性和有效的殺傷性,其中以靶向CD19分子的CAR-CD19T在治療白血病和淋巴瘤中獲得了令人興奮的結(jié)果,取得了巨大的成功。但是,CART細(xì)胞在實(shí)體瘤中的應(yīng)用并沒(méi)有取得很好的療效,主要是因?yàn)閷?shí)體瘤缺少真正的腫瘤特異性的抗原,還有其表面的腫瘤相關(guān)性抗原的異質(zhì)性。簡(jiǎn)而言之,就是選取不同的腫瘤相關(guān)性抗原作為CART細(xì)胞的靶點(diǎn),在不同的實(shí)體瘤取得的治療效果不同,即使是同一個(gè)腫瘤也有可能治療效果不一樣。因此,選擇腫瘤相關(guān)性抗原作為CART的靶點(diǎn)來(lái)治療實(shí)體瘤是很重要的。只有很少的腫瘤相關(guān)性抗原已經(jīng)被篩選出來(lái)作為治療NSCLC的CART細(xì)胞的靶點(diǎn)。最近有文獻(xiàn)報(bào)道,聚糖蛋白-3 (glypican-3)作為治療非小細(xì)胞肺癌中-肺鱗狀細(xì)胞癌,是非常有希望的CART的靶點(diǎn)。然而,在針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的CART細(xì)胞治療,在臨床一期的數(shù)據(jù)表明,在11個(gè)病人中只有2個(gè)病人達(dá)到了部分緩解。黏蛋白MUC1,是一種跨膜的糖蛋白,在很多類型的腫瘤,包括非小細(xì)胞肺癌都會(huì)有異常的高表達(dá)。以黏蛋白MUC1為CART細(xì)胞治療靶點(diǎn)的臨床試驗(yàn)正在招募四種類型的實(shí)體瘤病人,其中就包括非小細(xì)胞肺癌的病人(臨床試驗(yàn)編號(hào):NCT02587689)。因此,基于以上研究進(jìn)展,黏蛋白MUC1可以是作為治療非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)很有希望的CAR T細(xì)胞的靶點(diǎn)。前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)是以糖基磷脂酰肌醇(GPI)方式錨定在細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)性抗原,主要是在前列腺癌表面異常高表達(dá),也有報(bào)道說(shuō)PSCA也在其他腫瘤表面,例如膽囊腺癌和胃癌。有意思的是,也有報(bào)道證明PSCA經(jīng)常在非小細(xì)胞肺癌肺癌中過(guò)表達(dá)。當(dāng)然,PSCA是否在非小細(xì)胞肺癌中具有普遍性的過(guò)表達(dá)還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。但是基于PSCA抗原的治療方案到目前來(lái)說(shuō)已經(jīng)比較成熟。有很多報(bào)道表明,基于抗PSCA抗體的,以PSCA作為靶點(diǎn)的治療方式,以及多肽疫苗已經(jīng)用來(lái)治療前列腺癌。進(jìn)一步來(lái)說(shuō),以PSCA為靶點(diǎn)的CART細(xì)胞療法已經(jīng)用來(lái)在人源化小鼠中來(lái)治療胰腺癌。而且,靶向PSCA抗原的CART細(xì)胞治療前列腺癌,膀胱癌和胰腺癌的臨床試驗(yàn)已經(jīng)在進(jìn)行中(臨床試驗(yàn)編號(hào):NCT02092948; NCT02744287)。以上的臨床前實(shí)驗(yàn)以及在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)已經(jīng)充分說(shuō)明PSCA是一個(gè)很理想的CART細(xì)胞治療靶點(diǎn)。但是,關(guān)于PSCA是否也可以作為治療非小細(xì)胞肺癌的CART細(xì)胞的靶點(diǎn),還沒(méi)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。這也是本文中需要研究證明的。病人來(lái)源的異種移植模型(PDX model)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中,特別是人類癌癥的研究。在PDX模型中,來(lái)自病人的原代標(biāo)本可以在免疫缺陷的小鼠中不斷傳代,而且在不同的代數(shù)之間保持了與原代標(biāo)本基本上相同的特征。在本論文的第一部分,我們首先建立了病人來(lái)源的非小細(xì)胞肺癌的PDX模型,并且驗(yàn)證了在小鼠體內(nèi)的非小細(xì)胞肺癌仍然維持著與原代病人標(biāo)本相似的形態(tài)、免疫表型、分子標(biāo)記、基因表達(dá)水平等特點(diǎn)。緊接著的下一步實(shí)驗(yàn),我們用免疫組化的方式證明了在非小細(xì)胞肺癌PDX模型中確實(shí)有MUC1和PSCA過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象。然后,我們分別成功構(gòu)建了靶向MUC1和PSCA的嵌合抗原受體(MUC1.CAR和PSCA.CAR)的慢病毒載體,并在體外用肺癌細(xì)胞系驗(yàn)證了靶向MUC1和PSCA的嵌合抗原受體T細(xì)胞殺傷的特異性以及有效性。最后,在PDX模型中,靶向PSCA的嵌合抗原受體T細(xì)胞可以抑制異常高表達(dá)PSCA的非小細(xì)胞肺癌在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。更重要的是,靶向PSCA的嵌合抗原受體T細(xì)胞聯(lián)合靶向MUC1的嵌合抗原受體T細(xì)胞,在治療PDX模型中表達(dá)PSCA和MUC1雙陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌的效果更加顯著。綜上所述,在本論文中,我們的研究表明腫瘤相關(guān)性抗原PSCA和MUC1都可以作為治療非小細(xì)胞肺癌的CAR T細(xì)胞的很好的靶點(diǎn),而且兩種CAR T細(xì)胞的聯(lián)合治療會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)抗腫瘤的療效。
[Abstract]:Lung cancer is one of the most common malignancies worldwide. About 85% of lung cancer types are non-small cell lung cancer (NSCLC). Currently, lung cancer is usually treated by surgery, radiotherapy, chemotherapy, but these common treatments do not significantly prolong the survival cycle of lung cancer patients. Effective drugs for NSCLC include epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitors (TKI), echinoderm microtubule-associated protein-4 (EML4) / anaplastic lymphoma kinase (ALK) fusion gene EML4-ALK mutations, and other molecules. Targeted drugs. Molecular targeted drugs have a good therapeutic effect, but lung cancer patients are often resistant to drugs for about a year. And recently introduced tumor immunotherapy, such as immunocheckpoint inhibitor CTLA-4 antibody, PD-1 antibody, PD-L1 antibody is effective in some patients, but not in others. So immunoassay The efficacy of point-checking inhibitors needs to be further improved. Therefore, new treatments are still needed for lung cancer. Chimeric antigen receptor gene-modified T cells (CART), as tumor-targeted immunotherapy, have shown good targeting and effective killing effects in vitro and clinical trials, including CAR-CD19T, which targets CD19 molecules. The exciting results have been achieved in the treatment of leukemia and lymphoma, and great success has been achieved. However, the use of CART cells in solid tumors has not been very effective, mainly because solid tumors lack real tumor-specific antigens, and the heterogeneity of tumor-associated antigens on their surfaces. Choosing different tumor-associated antigens as the targets of CART cells has different therapeutic effects in different solid tumors, and even the same tumor may have different therapeutic effects. Therefore, it is important to select tumor-associated antigens as the targets of CART to treat solid tumors. Recently, it has been reported that polyglycoprotein-3 (glypican-3) is a promising target for CART in non-small cell lung cancer (NSCLC). Mucoprotein MUC1, a transmembrane glycoprotein, is abnormally high in many types of tumors, including non-small cell lung cancer. Clinical trials targeting mucin MUC1 as a CART cell therapy target are recruiting four types of solid tumor patients, including non-small cell lung cancer. Patient (Clinical Trial Number: NCT02587689). Therefore, based on these advances, mucin MUC1 may be a promising target for the treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC). Prostate stem cell antigen (PSCA) is a tumor-associated antigen anchored on the cell surface by glycosylphosphatidylinositol (GPI), predominantly preceding. It is interesting to note that PSCA is frequently overexpressed in non-small cell lung cancer. Of course, whether PSCA is ubiquitous in non-small cell lung cancer needs further validation. Antigen-based therapies have been well established. Many reports have shown that PSCA-targeted therapies based on anti-PSCA antibodies, and polypeptide vaccines have been used to treat prostate cancer. Furthermore, PSCA-targeted CART cell therapies have been used to treat pancreatic cancer in humanized mice. Pre-clinical trials and clinical trials have shown that PSCA is an ideal target for the treatment of prostate cancer, bladder cancer and pancreatic cancer (clinical trial number: NCT02092948; NCT02744287). Patient-derived xenotransplantation (PDX) models have been widely used in translational medicine, especially in the study of human cancers. In PDX models, primary specimens from patients can be used in the treatment of non-small cell lung cancer. In the first part of this paper, we first established a PDX model of patient-derived non-small cell lung cancer (NSCLC) and verified that NSCLC in mice still maintained the same characteristics as the original specimen. Similar morphology, immunophenotype, molecular markers, and gene expression levels were observed. Next step, we demonstrated that MUC1 and PSCA were overexpressed in the PDX model of non-small cell lung cancer by immunohistochemistry. Then, we successfully constructed chimeric antigen receptors (MUC1.CAR and PSCA.C) targeting MUC1 and PSCA, respectively. Finally, in PDX model, chimeric antigen receptor T cells targeting PSCA can inhibit the growth of non-small cell lung cancer cells with abnormally high expression of PSCA. Chimeric antigen receptor T cells targeting MUC1 combined with chimeric antigen receptor T cells targeting PSCA are more effective in the treatment of non-small cell lung cancer with positive expression of PSCA and MUC1 in PDX models. The combination of two CAR T cells will further enhance the antitumor efficacy.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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