【摘要】：腫瘤細胞具有多種特性,而惡性腫瘤的基本生物學特征是細胞無限制的增殖和腫瘤細胞的侵襲與轉移,后者是腫瘤患者重要的死亡原因之一。目前肺癌的發(fā)病率和死亡率已居首位,且嚴重威脅人類健康。盡管臨床診斷和治療技術不斷發(fā)展,但患者的5年生存率長期徘徊在30%左右,深入研究其發(fā)生及發(fā)展的分子機制,將為臨床治療提供新的理論基礎,有助于改進肺癌治療的有效性。MARVELD1是本課題組發(fā)現(xiàn)的一個侯選的腫瘤抑制基因,其在在乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤組織中表達顯著下調,但深入的作用機制尚不明確。因此,本論文采用組織芯片、細胞周期同步化、RNA-seq高通量檢測、表達調控分析等技術對MARVELD1在肺癌中的作用及其分子基礎開展了深入的研究。研究中首先利用組織芯片免疫組化染色分析MARVELD1在肺癌中的表達,發(fā)現(xiàn)MARVELD1在多種組織類型的肺癌中表達明顯下調。分析MARVELD1與肺癌病例特征的關系,證實MARVELD1與TNM分期顯著負相關,與生存期顯著正相關。免疫印跡技術分析MARVELD1在多種不同病理分型的肺癌細胞系中的表達情況,證實了在肺癌細胞中MARVELD1表達的下調。研究進一步利用亞硫酸鹽甲基化測序分析技術,揭示了MARVLED1在肺癌細胞中表達下調的分子機制。鑒于惡性增殖是腫瘤的最基本生物學特性,結合MARVELD1在肺癌組織細胞中表達下調的特點,研究進一步分析其對肺癌細胞增殖抑制的能力。分析發(fā)現(xiàn)MARVELD1能夠抑制A549細胞的體外增殖,抑制細胞周期并阻滯在G1期。通過周期同步化技術分析MARVELD1的表達與周期進程的關系,發(fā)現(xiàn)MARVELD1表達伴隨著細胞周期進程而增加,其在S期表達較低,G2/M期表達較高。周期同步化和免疫共沉淀技術分析還表明MARVELD1能夠與H4K20me1特異性結合,且調控細胞周期G1期進程。分析MARVELD1調控細胞周期G1期進程的分子機制,發(fā)現(xiàn)MARVELD1與p53啟動子區(qū)結合,正調控P53的表達,引發(fā)了Cyclin D1的表達下調,從而抑制細胞周期從G1期向S期的進程。轉移是惡性腫瘤另一主要基本生物學特征,也是最重要的特性。為探討MARVELD1對肺癌細胞遷移運動的影響,本研究首先通過掃描電鏡和原子力顯微鏡觀察了MARVELD1對細胞表面超微結構及力學特性的影響,發(fā)現(xiàn)MARVELD1能夠增加細胞表面微絨毛的長度及形態(tài)特征,增加細胞的楊氏模量。進一步利用RNA-seq高通量測序技術分析MARVELD1表達對全基因組的影響時,發(fā)現(xiàn)MARVELD1可負調控整聯(lián)蛋白β1和正調控整聯(lián)蛋白β4的表達。為此,研究通過ChIP、熒光素酶報告基因系統(tǒng)及RNA-IP技術分析了MARVELD1調控其表達的分子機制,由此揭示MARVELD1影響整聯(lián)蛋白β1和β4在微絨毛尾部的定位。采用細胞鋪展實驗、細胞劃痕愈傷和侵襲小室技術分析,證實MARVELD1具有通過下調整聯(lián)蛋白β1的表達抑制細胞遷移,通過上調整聯(lián)蛋白β4表達增強細胞與基底的粘附的雙重功能。在以上研究基礎上,本文進一步探討了MARVELD1對肺癌細胞上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影響,形態(tài)學研究結果表明,MARVELD1具有維持細胞上皮樣形態(tài)的能力。實時定量PCR和免疫印跡等試驗進一步證實MARVELD1能夠抑制TGF-β1誘導的上皮間質轉化過程。其抑制EMT的分子機制為MARVELD1能夠通過調控整聯(lián)蛋白β1/β4的表達平衡抑制TGF-β1誘導上皮間質轉化。綜上所述,本文通過對MARVELD1在肺癌中的表達模式分析及對細胞周期及細胞遷移運動影響的研究,表明其在調控細胞周期、抑制細胞運動及上皮間質轉化中具有重要生物學功能。鑒于MARVELD1在肺癌中影響了多個網絡信號通路,因此MARVELD1在肺癌發(fā)生及發(fā)展中具有十分重要的作用。
[Abstract]:Tumor cells have many characteristics, and the basic biological characteristics of malignant tumors are unlimited proliferation of cells and invasion and metastasis of tumor cells. The latter is one of the important causes of death in cancer patients. MARVELD1 is a candidate tumor suppressor gene found by our team, which is found in breast cancer, liver cancer and other malignant tumors. The expression of MARVELD1 in lung cancer was significantly down-regulated, but the underlying mechanism was still unclear. In this study, tissue microarrays, cell cycle synchronization, RNA-seq high-throughput detection, expression regulation analysis and other techniques were used to investigate the role of MARVELD1 in lung cancer and its molecular basis. The expression of MARVELD1 in lung cancer was significantly down-regulated in various histological types of lung cancer. The relationship between MARVELD1 and the characteristics of lung cancer was analyzed. It was confirmed that MARVELD1 was negatively correlated with TNM stage and positively correlated with survival time. The expression of MARVELD1 in lung cancer cell lines with different pathological types was analyzed by Western blot. The down-regulation of MARVELD1 expression in lung cancer cells was confirmed. The molecular mechanism of down-regulation of MARVELD1 expression in lung cancer cells was revealed by sulfite methylation sequencing analysis. The results showed that MARVELD1 could inhibit the proliferation of A549 cells in vitro, inhibit cell cycle and block cell cycle in G1 phase. Cycle synchronization and immunoprecipitation analysis also showed that MARVELD1 could specifically bind to H4K20me1 and regulate the G1 phase of cell cycle. To investigate the effect of MARVELD1 on the migration and movement of lung cancer cells, the ultrastructure of the cell surface was observed by scanning electron microscopy and atomic force microscopy. It was found that MARVELD1 could increase the length and morphological characteristics of microvilli on the surface of cells and increase Young's modulus of cells. Further analysis of the effect of MARVELD1 expression on the whole genome by RNA-seq high-throughput sequencing showed that MARVELD1 could negatively regulate the expression of integrin beta 1 and positively regulate the expression of integrin beta 4. The molecular mechanism of MARVELD1 regulating its expression was analyzed by ChIP, luciferase reporter gene system and RNA-IP technique, which revealed that MARVELD1 affected the localization of integrin beta 1 and beta 4 in the tail of microvilli. The expression of white beta-1 inhibits cell migration by up-regulating the expression of connexin beta-4 and enhances cell-substrate adhesion. On the basis of the above studies, the effects of MARVELD1 on the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of lung cancer cells were further investigated. Morphological studies showed that MARVELD1 has a dimension. MARVELD1 can inhibit the epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-beta 1. The molecular mechanism of MARVELD1 inhibiting EMT is that MARVELD1 can inhibit the epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-beta 1 by regulating the balance of expression of integrin beta 1/beta 4. Studies on the expression pattern of MARVELD1 in lung cancer and its effect on cell cycle and migration showed that MARVELD1 has important biological functions in regulating cell cycle, inhibiting cell movement and epithelial-mesenchymal transition. Exhibition plays a very important role.
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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