【摘要】：目的:研究抑癌基因TSC2(Tuberous Sclerosis Complex 2)表達降低對白血病U937細胞系的生長、增殖、分化和凋亡的影響及其對mTORC1(mammalian target of rapamycin,mTOR complex 1)通路蛋白激酶及其靶分子活性的影響,揭示急性白血病發(fā)生的新機制。方法:選擇TSC2高表達的U937細胞,通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)下調(diào)TSC2基因表達,篩選出GFP陽性率高的細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,采用CCK-8法和細胞克隆形成能力實驗檢測細胞的增殖活力;用PI(碘化丙啶)標記流式細胞術(shù)檢測細胞周期;用流式細胞儀檢測細胞分化;采用AnnexinV-PE/7-AAD雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡;通過蛋白印記實驗,檢測TSC2表達下調(diào)對mTORC1信號通路蛋白活性的影響;采用實時定量PCR法檢測TSC2基因低表達對mTORC1通路下游靶基因表達的影響。結(jié)果:1.慢病毒感染U937細胞后,實時定量PCR方法檢測TSC2 mRNA的表達,干擾效率為71.7%;Western blot方法檢測蛋白表達,可見TSC2蛋白的表達量明顯下調(diào)。2.下調(diào)TSC2基因表達對U937細胞的生物學(xué)作用:CCK-8細胞增殖實驗結(jié)果表明,TSC2基因表達下調(diào)后,細胞增殖活性增強,與未感染組細胞(空白對照)相比,實驗組增殖活性增強了(5.15±0.72)倍,空載病毒組增殖活性增強了(1.92±0.63)倍,兩組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);細胞克隆形成能力實驗表明,與空載病毒對照組相比,實驗組的細胞集落形成能力明顯增強(P0.05);細胞周期實驗結(jié)果表明:與空病毒組相比,實驗組細胞G1期比例明顯降低(P0.05),G2/M期細胞比例增高(P0.05),S期比例增高(P0.05);流式細胞儀檢測細胞分化結(jié)果表明,與空載病毒對照組相比,實驗組細胞CD13、CD33、CD11b、CD15、CD14、CD64表達無明顯變化;流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果表明,TSC2表達降低對細胞凋亡無明顯改變(P0.05)。3.TSC2基因表達下調(diào)對mTORC1通路蛋白的影響:Western blot方法檢測mTOR及其下游分子的表達結(jié)果表明,TSC2表達下調(diào)后,mTOR總蛋白未見明顯變化,而磷酸化p-mTOR(Ser2448)表達升高;底物激酶P70S6K和4EBP1總蛋白未見明顯變化,但是活性形式p-P70S6K(Thr389)和p-4EBP1(Thr37/46)的表達明顯升高;AKT總蛋白及活性形式的p-AKT的表達未見明顯變化;實時定量PCR結(jié)果表明,與細胞增殖相關(guān)的基因cyclinD1、c-myc和PTEN表達量明顯升高,P27kip1基因、凋亡相關(guān)基因BCL-XL表達量沒有明顯變化。結(jié)論:TSC2基因表達下調(diào)可以通過調(diào)節(jié)mTORC1信號通路的活性促進白血病細胞的增殖能力,為急性白血病的分子發(fā)病機制以及靶向治療提供了進一步的分子理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:AIM: To investigate the effects of TSC2 (Tuberous Sclerosis Complex 2) down-regulation on the growth, proliferation, differentiation and apoptosis of leukemia U937 cell line and the activity of protein kinase and its target molecule in the mTORC1 (mammalian target of rapamycin, mTOR complex 1) pathway, and to reveal the new mechanism of acute leukemia. U937 cells with high expression of TSC2 were selected, and TSC2 gene expression was down-regulated by lentivirus-mediated RNA interference. The cells with high positive rate of GFP were screened out and cultured to logarithmic growth stage. Cell proliferation activity was detected by CCK-8 assay and cell cloning ability assay. Cell cycle was detected by PI (propidium iodide) labeling flow cytometry. Cell differentiation was detected by the instrument; apoptosis was detected by Annexin V-PE/7-AAD double staining flow cytometry; the effect of TSC2 down-regulation on the activity of mTORC1 signaling pathway protein was detected by Western blotting; and the effect of TSC2 down-regulation on the expression of target genes downstream of mTORC1 pathway was detected by real-time quantitative PCR. The expression of TSC2 mRNA was detected by real-time quantitative PCR, and the interference efficiency was 71.7%. The expression of TSC2 protein was significantly down-regulated by Western blot. 2. The biological effect of TSC2 gene down-regulated on U937 cells: CCK-8 cell proliferation experiment showed that TSC2 gene down-regulated cell proliferation activity increased. Compared with the uninfected group (blank control), the proliferative activity of the experimental group increased (5.15 + 0.72) times, and that of the viral group increased (1.92 + 0.63) times. The difference between the two groups was statistically significant (P 0.05). Cell cloning ability test showed that compared with the viral control group, the colony forming ability of the experimental group was obvious. Cell cycle test showed that compared with the empty virus group, the G1 phase ratio decreased significantly (P 0.05), G2 / M phase ratio increased (P 0.05), S phase ratio increased (P 0.05); Flow cytometry showed that compared with the empty virus control group, the experimental group cells CD13, CD33, CD11b, CD15, CD14, CD64 expression. The results of flow cytometry showed that there was no significant change in TSC2 expression (P 0.05). 3. The effect of TSC2 down-regulation on mTORC1 pathway protein: Western blot assay showed that the total protein of mTOR did not change significantly after TSC2 down-regulation, but phosphorus. The expression of acidified p-mTOR (Ser2448) was elevated, the total protein of substrate kinase P70S6K and 4EBP1 was not changed significantly, but the expression of active forms p-P70S6K (Thr389) and p-4EBP1 (Thr37/46) were significantly increased, the expression of total protein and active form of AKT were not changed significantly, and the results of real-time quantitative PCR showed that cyclinD1, c-myc genes related to cell proliferation were not changed. Conclusion: Downregulation of TSC2 gene expression can promote the proliferation of leukemic cells by regulating the activity of mTORC1 signaling pathway, which provides a further theoretical basis for the molecular pathogenesis and targeted therapy of acute leukemia. Foundation.
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.7

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本文編號：2224391