【摘要】：背景與目的在全世界最常見的惡性腫瘤中,食管癌的發(fā)病率位居第8,死亡率位居第6位。在過去的40年中,隨著診斷、手術(shù)和放化療水平的不斷提高,食管癌的5年生存率緩慢升高,但是依然低于19%。食管癌有兩種主要的病理類型:食管腺癌和食管鱗癌。中國是世界上食管癌的高發(fā)地區(qū)之一,其中食管鱗癌占95%,是國內(nèi)發(fā)病率第3、死亡率第4位的惡性腫瘤。和腺癌相比較,食管鱗癌的預(yù)后更差,其根治性手術(shù)后的10年生存率長期徘徊在20%左右。目前已經(jīng)證實,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是食管鱗癌最重要的預(yù)后因素之一,食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的狀態(tài)決定腫瘤的分期、治療方式的選擇和預(yù)后。但是目前食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機制尚不清楚,臨床上也缺乏有效的預(yù)測和治療食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的方法。Sox-3是一種轉(zhuǎn)錄因子,歸屬于Sox蛋白家族B1亞組。在脊椎動物胚胎發(fā)育早期調(diào)控神經(jīng)細胞的發(fā)育和分化,并在發(fā)育過程中表達逐步降。近年來的研究發(fā)現(xiàn),Sox-3是一種原癌基因,可能和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。我們在前期的研究中,發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織Sox-3的表達與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān),表現(xiàn)為Sox-3高表達患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯升高,并且預(yù)后不良。提示Sox-3的表達可能促進了食管鱗癌的淋巴轉(zhuǎn)移,并影響患者的預(yù)后。已有的證據(jù)表明,食管鱗癌患者腫瘤相關(guān)淋巴管的密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。而VEGF-C/D-VEGFR3是調(diào)控淋巴管生成、淋巴管擴張和通透性主要的信號通路。VEGF-C或VEGF-D的高表達與腫瘤侵犯的深度、腫瘤分期、腫瘤淋巴管的密度、淋巴管受侵和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。綜上,我們推測Sox-3的表達可能促進食管鱗癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移,并且和淋巴管生成以及VEGF-C/D-VEGFR3信號系統(tǒng)相關(guān)。為了闡明Sox-3在食管鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移中的作用及可能的機制,我們利用本實驗室已經(jīng)構(gòu)建的不同Sox-3表達水平的人食管鱗癌細胞模型,通過體外和體內(nèi)實驗,選擇Western blot、RT-PCR、ELISA、免疫組化研究等方法研究,探討Sox-3在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用及其可能的機制,為探索食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷和靶向治療提供新的方向。方法1.利用本實驗室構(gòu)建的不同Sox-3表達水平的食管鱗癌細胞模型,通過Western blot和q RT-PCR驗證其Sox-3的差異表達后,通過細胞培養(yǎng)、MTT增殖實驗、流式細胞術(shù)、劃痕實驗、Transwell侵襲實驗和條件培養(yǎng)基淋巴管內(nèi)皮細胞成管實驗考察在體外Sox-3的表達,對于人食管鱗癌TE-10細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移,特別是誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細胞成管能力的影響。研究Sox-3對于食管鱗癌發(fā)生發(fā)展和淋巴轉(zhuǎn)移可能的調(diào)控作用。2.通過裸鼠右側(cè)腋下注射不同Sox-3表達水平的TE-10細胞,構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。對移植瘤的發(fā)生、發(fā)展過程、成瘤的大小和同側(cè)腋窩淋巴結(jié)的大小進行比較,組織切片HE染色,檢查比較淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況;通過Western blot和免疫組化,檢測不同Sox-3表達水平的TE-10細胞移植瘤樣本中VEGF-C/D的表達,來進一步研究Sox-3對于食管鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移的影響。3.在體外細胞培養(yǎng),通過Western blot和ELISA實驗檢測抑制Sox-3的表達,對于TE-10細胞VEGF-C/D表達和分泌的影響。在淋巴管內(nèi)皮細胞成管實驗中,加入VEGFR-3的抗體SAR131675阻斷淋巴管內(nèi)皮細胞VEGFR-3的功能,來研究VEGF-C/D通路在Sox-3促進食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中可能的作用機制。結(jié)果1.通過Western blot實驗和q RT-PCR實驗證實,TE-10細胞經(jīng)Sox-3 si RNA慢病毒感染后構(gòu)建的不同Sox-3表達的人食管鱗癌細胞模型是成功的,對照組TE-10細胞和空載組TE-10細胞Sox-3的表達類似,均顯著高于干擾組TE-10細胞。MTT、流式細胞術(shù)、劃痕實驗、transwell實驗和條件培養(yǎng)基淋巴管內(nèi)皮細胞成管實驗證實:Sox-3可顯著促進人食管鱗癌細胞的增殖、侵襲、遷移和淋巴管內(nèi)皮細胞成管的能力,而對細胞凋亡有抑制作用。2.成功構(gòu)建裸鼠移植瘤模型,測量結(jié)果顯示:和Sox-3低表達的干擾組相比,Sox-3高表達的空載組小鼠移植瘤的生長速度和成瘤大小類似,但是移植瘤同側(cè)腋窩淋巴結(jié)的體積顯著增大。病理學(xué)檢查顯示Sox-3高表達組小鼠淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率顯著增高。Western blot和免疫組化檢測顯示,空載組移植瘤組織VEGF-C和VEGF-D的表達均顯著強于干擾組。表明表明Sox-3對食管鱗癌TE-10細胞體內(nèi)成瘤和生長的影響不大,但是可能促進食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,并且和VEGF-C和VEGF-D的表達相關(guān)。3.Western blot和ELISA實驗結(jié)果顯示,抑制TE-10細胞Sox-3的表達,可使其VEGF-C和VEGF-D的表達和分泌顯著下降;在淋巴管內(nèi)皮細胞成管實驗中,使用SAR131675阻斷淋巴管內(nèi)皮細胞VEGFR-3的功能后,各組TE-10細胞成管的數(shù)目均顯著下降,并且組間無差異。表明Sox-3在食管鱗癌TE-10細胞可顯著上調(diào)VEGF-C和VEGF-D的表達和分泌,Sox-3促進淋巴管的生成,是通過VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3通路實現(xiàn)的。結(jié)論1.在體外Sox-3可顯著促進人食管鱗癌細胞的增殖、侵襲和遷移,抑制細胞凋亡,但是在體內(nèi)Sox-3對于食管鱗癌細胞成瘤的速度和大小影響不大。2.在體外Sox-3可顯著增強人食管鱗癌細胞誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細胞成管的能力,在體內(nèi)Sox-3可促進食管鱗癌細胞成瘤后的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。3.Sox-3在食管鱗癌細胞的表達,上調(diào)腫瘤VEGF-C和VEGF-D的表達和分泌,作用于淋巴管內(nèi)皮細胞,通過VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3通路,促進淋巴管的生成,是Sox-3促進食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能的機制。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE Among the most common malignant tumors in the world, esophageal cancer ranks eighth in incidence and sixth in mortality. Over the past 40 years, the 5-year survival rate of esophageal cancer has slowly increased, but is still lower than 19% with the improvement of diagnosis, surgery, radiotherapy and chemotherapy. There are two major pathological types of esophageal cancer: adenocarcinoma and carcinoma of the esophagus. Esophageal squamous cell carcinoma is one of the most common esophageal cancers in the world. Esophageal squamous cell carcinoma accounts for 95% of all esophageal cancers in China. It is the third most common malignancy and the fourth leading cause of death in China. Compared with adenocarcinoma, esophageal squamous cell carcinoma has a worse prognosis, and its 10-year survival rate after radical surgery has long hovered around 20%. One of the most important prognostic factors of esophageal squamous cell carcinoma is the state of lymph node metastasis, which determines the stage, treatment and prognosis of esophageal squamous cell carcinoma. Subgroup B1 of the protein family regulates the development and differentiation of neural cells in early embryonic development of vertebrates and gradually decreases their expression during development. Recent studies have shown that Sox-3 is a proto-oncogene and may be associated with the development of tumors. In our previous studies, we found that the expression of Sox-3 in esophageal squamous cell carcinoma tissue and regional lymph nodes. The expression of Sox-3 may promote lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma and affect the prognosis of the patients. There is evidence that the density of tumor-associated lymphatic vessels is associated with lymph node metastasis and prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma. The high expression of VEGF-C or VEGF-D is associated with the depth of tumor invasion, tumor stage, density of tumor lymphatic vessels, lymphatic invasion and lymph node metastasis. In conclusion, we speculate that the expression of Sox-3 may promote lymph node metastasis in esophageal squamous cell carcinoma. In order to elucidate the role of Sox-3 in lymphatic metastasis of esophageal squamous cell carcinoma and its possible mechanism, we used human esophageal squamous cell carcinoma cell models with different levels of Sox-3 expression to select Western blot, RT-PCR, ELISA in vitro and in vivo. To explore the role of Sox-3 in the occurrence, development and lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and its possible mechanism by immunohistochemical methods, and to provide a new direction for the diagnosis and targeted therapy of ESCC with lymph node metastasis. Methods 1. Using the different expression levels of Sox-3 in our laboratory, we constructed a cell model of ESCC. Western blot and Q RT-PCR confirmed the differential expression of Sox-3 in human esophageal squamous cell carcinoma TE-10 cells. The expression of Sox-3 in vitro was examined by cell culture, MTT proliferation, flow cytometry, scratch test, Transwell invasion test and conditioned medium lymphatic endothelial cell tube formation test, especially induction of proliferation, apoptosis, invasion, migration of human esophageal squamous cell carcinoma TE-10 cells. To study the effect of Sox-3 on the development and lymphatic metastasis of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). The effect of Sox-3 on lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma was further studied by Western blot and ELISA. The effect of inhibition of Sox-3 expression on the expression and secretion of VEGF-C/D in TE-10 cells was investigated. In the lymphatic endothelial cell tube formation experiment, anti-VEGFR-3 antibody SAR131675 was added to block the function of lymphatic endothelial cells in order to study the possible mechanism of VEGF-C/D pathway in promoting lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma. 1. Western blot assay and Q RT-PCR assay confirmed that the human esophageal squamous cell carcinoma cell models with different expression of Sox-3 were successfully constructed by TE-10 cells infected with Sox-3 Si RNA lentivirus. The expression of Sox-3 in TE-10 cells of control group and TE-10 cells of no-load group were similar, which were significantly higher than that of TE-10 cells of interference group. MTT, flow cytometry, scratch test, tra. Nswell test and conditioned medium lymphatic endothelial cell tubing test confirmed that Sox-3 can significantly promote the proliferation, invasion, migration and lymphatic endothelial cell tubing ability of human esophageal squamous cell carcinoma cells, but inhibit cell apoptosis. 2. Successful construction of nude mice transplantation tumor model, the results showed that: compared with the low expression of Sox-3 interfering group, The growth rate and tumor size of the transplanted tumor were similar in the no-load group with high expression of Sox-3, but the volume of axillary lymph nodes on the ipsilateral side of the transplanted tumor was significantly increased. The results of Western blot and ELISA showed that inhibiting the expression of Sox-3 in TE-10 cells could promote the lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma. The expression and secretion of VEGF-C and VEGF-D were significantly decreased in the lymphatic endothelial cells. In the lymphatic vessel endothelial cells tube-forming experiment, the number of tubes of TE-10 cells in each group was significantly decreased after blocking the function of VEGF R-3 by SAR131675, and there was no difference between groups. Lymphangiogenesis is achieved through the VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3 pathway. Conclusion 1. Sox-3 can significantly promote the proliferation, invasion and migration of human esophageal squamous cell carcinoma cells in vitro, and inhibit cell apoptosis, but in vivo Sox-3 has little effect on the tumor formation rate and size of esophageal squamous cell carcinoma cells. 2. Sox-3 can significantly enhance the fineness of human esophageal squamous cell carcinoma cells in vitro. Sox-3 can promote lymphatic metastasis of esophageal squamous cell carcinoma cells after tumor formation. 3. Sox-3 can up-regulate the expression and secretion of VEGF-C and VEGF-D in esophageal squamous cell carcinoma cells. It acts on lymphatic endothelial cells and promotes lymphatic angiogenesis through the VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3 pathway. Possible mechanisms of lymph node metastasis in esophageal squamous cell carcinoma.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

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本文編號：2180543