【摘要】：食管癌是世界上常見的一種消化道惡性腫瘤。在中國,食管鱗狀細(xì)胞癌(食管鱗癌,esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌最主要的組織學(xué)類型。河南是中國食管鱗癌的高發(fā)區(qū)之一,而且是病死率最高的地區(qū)。由于食管癌起病隱匿,其早期癥狀多因不典型而易被忽略,以致大多數(shù)患者常常拖延至中晚期才被發(fā)現(xiàn)。近年來,大量研究表明,腫瘤患者血液循環(huán)中不僅存在大量的腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigens,TAAs)及其自身抗體(即腫瘤相關(guān)自身抗體,tumor associated autoantibodies,TAAbs),也存在多種microRNAs(miRNAs),它們可在患者體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá),并且在不同腫瘤中的表達(dá)譜不同,因此,可作為新的非侵入性腫瘤標(biāo)志物用于食管鱗癌的診斷。目的本研究通過檢測七種TAAbs(anti-HCCR-1、anti-p53、anti-p62、anti-C-myc、anti-NICD、anti-hnRNP A2/B1和anti-MDM2)和兩種miRNAs(mi R-21和miR-25)在食管鱗癌患者和正常對照血漿中的表達(dá)水平,來評價這兩類腫瘤標(biāo)志物對食管鱗癌的診斷價值,從而為實現(xiàn)食管鱗癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療提供理論依據(jù)。方法1.HCCR-1重組蛋白的表達(dá)和純化:將預(yù)先構(gòu)建好的HCCR-1重組質(zhì)粒(pET-30a(+)-HCCR-1)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),然后運(yùn)用鎳離子親和層析法對表達(dá)的HCCR-1目的蛋白進(jìn)行純化,并采用Bradford法測定其濃度。2.收集醫(yī)院來源的新發(fā)食管鱗癌患者的血漿125例,并按照性別和年齡進(jìn)行匹配,收集同時期參加體檢的健康對照者的血漿125例。3.采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測所有受試對象血漿中七種TAAbs的相對表達(dá)水平。4.采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測所有受試對象血漿中miR-21和mi R-25的相對表達(dá)水平。5.采用t檢驗比較TAAbs和miRNAs在食管鱗癌患者和正常對照個體血漿中相對表達(dá)水平的差異;采用卡方檢驗或Fisher確切概率法比較TAAbs和miRNAs與食管鱗癌患者臨床基本特征之間的關(guān)系;分別采用t檢驗和方差分析比較兩組和三組間TAAbs和miRNAs在食管鱗癌患者血漿中的表達(dá)水平是否有差異;采用診斷試驗的評價方法,評價單個指標(biāo)單獨檢測及多個指標(biāo)聯(lián)合檢測對食管鱗癌的診斷價值;采用ROC(receiver operating characteristic)分析計算不同指標(biāo)及其組合診斷食管鱗癌時在該曲線下的面積(area under the ROC curve,AUC)。結(jié)果1.成功表達(dá)并純化出HCCR-1重組蛋白,其濃度為0.28 mg/mL。2.七種TAAbs的ELISA結(jié)果顯示,除anti-NICD和anti-hnRNP A2/B1外,其余五種TAAbs(anti-HCCR-1、anti-p53、anti-p62、anti-C-myc和anti-MDM2)在食管鱗癌組的表達(dá)水平明顯高于對照組中的表達(dá)水平(均有P0.05)。3.單個TAAb用于食管鱗癌診斷的靈敏度為7.2% 23.2%,特異度為93.6% 97.6%,AUC為0.522 0.728,診斷價值較低;以靈敏度最大的anti-MDM2為起點,逐漸并聯(lián)檢測多種TAAbs時,靈敏度可從23.2%升至60.8%,而AUC可達(dá)0.805。4.血漿中TAAbs的表達(dá)水平在不同性別、年齡及TNM分期(包括T、N和M分期)食管鱗癌患者中的分布均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。5.qRT-PCR結(jié)果顯示,miR-21在食管鱗癌組的含量均明顯高于對照組中的含量(P0.001),而miR-25的含量則在兩組間的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);ROC分析表明,miR-21對食管鱗癌診斷的靈敏度為74.4%,特異度為77.6%,AUC為0.804。6.miR-21和miR-25在血漿中的分布均與食管鱗癌患者的性別、年齡和M分期無關(guān)(P0.05),而與TNM分期和T分期密切相關(guān)(均有P0.01):miR-21和miR-25在0-I期的表達(dá)水平明顯高于II期(分別為P0.001,P=0.043)和III-IV期(分別為P0.001,P=0.017),在Tis-T1期的表達(dá)水平高于T2期(分別為P=0.003,P=0.037)和T3期(分別為P0.001,P=0.004);miR-21的分布與N分期無關(guān)(P0.05),而miR-25在N分期上的分布的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。7.ROC分析顯示,miR-21和miR-25對0-I期食管鱗癌患者的AUC分別為0.857和0.627,對Tis-T1期食管鱗癌的AUC分別為0.842和0.656。8.不同組合中,五種TAAbs(anti-HCCR-1、anti-p53、anti-p62、anti-C-myc和anti-MDM2)與miR-21進(jìn)行聯(lián)合檢測對食管鱗癌的診斷價值最高,其AUC為0.869,靈敏度和特異度分別為76.8%和84.8%;對0-I期食管鱗癌患者的AUC為0.889,對Tis-T1期食管鱗癌的AUC為0.882。結(jié)論1.血漿中的五種TAAbs(anti-HCCR-1、anti-p53、anti-p62、anti-C-myc和anti-MDM2)和miR-21是食管鱗癌的潛在診斷標(biāo)志物。2.所有TAAbs在血漿中的分布均與食管鱗癌的性別、年齡和TNM分期無關(guān),而miR-21和mi R-25的分布均與性別和年齡無關(guān)而與TNM分期有關(guān)。3.血漿miR-21和mi R-25的檢測有助于食管鱗癌的早期診斷。4.五種TAAbs與miR-21聯(lián)合檢測對食管鱗癌的診斷價值較高,尤其是早期食管鱗癌。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

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本文編號：2177688