發(fā)布時(shí)間：2018-07-28 09:39

【摘要】：研究目的：構(gòu)建攜帶胰島素樣生長因子2印跡(IGF2 Imprinting)系統(tǒng)的重組腺病毒,探討其用于靶向治療人結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)細(xì)胞株的可行性。研究方法：(1)使用PCR擴(kuò)增人源IGF2 Imprinting相關(guān)的結(jié)構(gòu)元件,包括H19啟動(dòng)子序列、enhancer及CTCF片段,并將其克隆到pDC-312載體中,最終構(gòu)建IGF2Imprinting系統(tǒng)；(2)從質(zhì)粒TopK和pEGFP-C1 vector中分別擴(kuò)增出E1A和EGFP片段,并將其插入到含有IGF2 Imprinting系統(tǒng)的重組質(zhì)粒中,用于構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒；(3)Topl0感受態(tài)細(xì)胞通過擴(kuò)增和純化,將腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC312-E1A,骨架質(zhì)粒Ad5通過脂質(zhì)體Lipo2000共轉(zhuǎn)染到人胚腎細(xì)胞(HEK293)中,包裝成具有感染能力的腺病毒Ad-H19-CTCF-enhancer-E1A和Ad-H19-CTCF-enhancer-EGFP,分別命名為Ad312-E1A和Ad312-EGFP;(4)利用腺病毒Ad312-EGFP分別感染IGF2印記丟失(IGF2 LOI)的結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29和HCT-8及IGF2印跡正常(IGF2 MOI)的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480和正常人胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1,通過熒光顯微鏡觀察不同細(xì)胞中EGFP的表達(dá)情況；(5)使用已上市的溶瘤腺病毒H101作為陽性對(duì)照,將Ad312-E1A和H101感染不同的細(xì)胞株,48 h后采用RT-PCR和Western Blot分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測各組細(xì)胞中E1A的nRNA及其蛋白的表達(dá)量；同時(shí),采用CCK-8法和流式細(xì)胞儀用以檢測腺病毒Ad312-E1A的體外殺傷腫瘤效應(yīng)；(6)構(gòu)建裸鼠腋下移植瘤模型,驗(yàn)證Ad312-E1A的體內(nèi)殺傷腫瘤效應(yīng)。研究結(jié)果：(1)成功轉(zhuǎn)染了穿梭質(zhì)粒pDC312-E1A和骨架質(zhì)粒Ad5到HEK293細(xì)胞中,EGFP在48 h表達(dá)最強(qiáng)；10-13 d,細(xì)胞病變效應(yīng)為陽性結(jié)果,通過3輪病毒的擴(kuò)增達(dá)到了合適的病毒滴度(1×109 pfu/ml);(2)利用重組腺病毒Ad312-EGFP分別感染不同的細(xì)胞株,48 h觀察,IGF2 LOI的細(xì)胞株(HT-29, HCT-8)出現(xiàn)了明顯的熒光,即表達(dá)了EGFP;(3)利用重組腺病毒Ad312-E1A分別感染不同的細(xì)胞株,48 h后發(fā)現(xiàn)E1A的mRNA和蛋白僅僅在IGF2 LOI細(xì)胞(HT-29、HCT-8)中表達(dá)；與正常對(duì)照PBS組相比,72 h后10 pfu/cell感染的IGF2 LOI細(xì)胞(HT-29、HCT-8)增殖活力分別下降(69.7±5.7)%和(65.2±7.1)%,凋亡率達(dá)到(33.4±4.1)%和(29.5±2.7)%；溶瘤腺病毒H101感染細(xì)胞株后,僅在p53突變的IGF2 LOI細(xì)胞(HT-29)中出現(xiàn)E1A mRNA和蛋白表達(dá),72 h后10 pfu/cell感染的HT-29細(xì)胞增殖活率下降(59.4±2.4)%,凋亡率為(38.6±3.2)%；(4)多點(diǎn)注射PBS、Ad312-EGFP、H101和Ad312-E1A治療HT-29細(xì)胞種植的裸鼠移植瘤,結(jié)果顯示腺病毒H101和Ad312-E1A均能有效的抑制腫瘤的生長并改善其預(yù)后。結(jié)論：(1)本研究成功的構(gòu)建了攜帶IGF2 Imprinting系統(tǒng)和腺病毒復(fù)制基因E1A的重組腺病毒；(2)重組腺病毒Ad312-E1A在體內(nèi)外均能有效的殺傷抑制IGF2 LOI的人結(jié)直腸癌細(xì)胞；(3) Ad312-E1A可以作為靶向治療CRC的一個(gè)新途徑,從而為CRC的基因靶向治療提供新思路。
[Abstract]:Aim: to construct recombinant adenovirus carrying insulin-like growth factor 2 blotting (IGF2 Imprinting) system and to explore the feasibility of targeting human colorectal cancer (colorectal cancer, CRC) cell line. Methods: (1) PCR was used to amplify human IGF2 Imprinting related structural elements, including H19 promoter enhancer and CTCF fragments, and cloned into pDC-312 vector to construct IGF2Imprinting system; (2) E1A and EGFP fragments were amplified from plasmids TopK and pEGFP-C1 vector, respectively. It was inserted into the recombinant plasmid containing IGF2 Imprinting system to construct the recombinant adenovirus shuttle plasmid. (3) Topl0 competent cells were amplified and purified. Adenovirus shuttle plasmid pDC312-E1A and skeleton plasmid Ad5 were co-transfected into human embryonic kidney cells (HEK293) by liposome Lipo2000. Ad-H19-CTCF-enhancer-E1A and Ad-H19-CTCF-enhancer-EGFP, named Ad312-E1A and Ad312-EGFP respectively; (4) Colorectal cancer cells HT-29 and HCT-8 infected with IGF2 imprinting loss (IGF2 LOI) and SW480 with IGF2 imprinted normal (IGF2 MOI) by adenovirus Ad312-EGFP, and normal colorectal cancer cells with IGF2 blotting (IGF2 MOI), respectively. The expression of EGFP was observed by fluorescence microscope in human gastric mucosal epithelial cell line GES-1. (5) after Ad312-E1A and H101 were infected with different cell lines 48 h later, RT-PCR and Western Blot were used to detect the expression of E1A nRNA and its protein at transcription and translation levels, respectively. CCK-8 assay and flow cytometry were used to detect the tumor killing effect of adenovirus Ad312-E1A in vitro. (6) A nude mouse model of axillary tumor transplantation was established to verify the killing effect of Ad312-E1A in vivo. The results were as follows: (1) the shuttle plasmid pDC312-E1A and the skeleton plasmid Ad5 were successfully transfected into the HEK293 cells at 48h, and the expression of pDC312-E1A was the strongest at 48h, and the cytopathic effect was positive. The suitable titer (1 脳 10 ~ 9 pfu/ml); (_ 2) was obtained by the amplification of three rotaviruses. The recombinant adenovirus Ad312-EGFP was used to infect different cell lines for 48 h to observe the obvious fluorescence of IGF2 LOI cell line (HT-29, HCT-8). (3) mRNA and protein of E1A were only expressed in IGF2 LOI cells (HT-29 HCT-8) after 48 h infection with recombinant adenovirus Ad312-E1A. The proliferative activity of IGF2 LOI cells (HT-29 HCT-8) infected with H101 for 10 pfu/cell was decreased by (69.7 鹵5.7)% and (65.2 鹵7.1), respectively, and the apoptotic rate was (33.4 鹵4.1)% and (29.5 鹵2.7), respectively, and that of H101 cells infected with adenolysin H101 was (33.4 鹵4.1)% and (29.5 鹵2.7), respectively. The proliferative activity of HT-29 cells infected with 10 pfu/cell was decreased (59.4 鹵2.4) and the apoptotic rate was (38.6 鹵3.2). (4) PBSAd312-EGFPFPH101 and Ad312-E1A were injected to treat the transplanted tumor of HT-29 cells in nude mice. The results showed that both adenovirus H101 and Ad312-E1A could effectively inhibit tumor growth and improve prognosis. Conclusion: (1) the recombinant adenovirus carrying IGF2 Imprinting system and adenovirus replication gene E1A was successfully constructed in this study. (2) the recombinant adenovirus Ad312-E1A could effectively kill human colorectal cancer cells which inhibited IGF2 LOI in vivo and in vitro. (3) Ad312-E1A can be used as a new way to target CRC and provide a new idea for gene targeting therapy of CRC.
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2149679