【摘要】：目的本實(shí)驗(yàn)利用乳腺癌體外細(xì)胞模型,探討短發(fā)夾RNA(sh RNA)介導(dǎo)的己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)基因沉默是否對乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性和放療效果有影響。通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建己糖激酶-2(HK2)低表達(dá)的穩(wěn)定的乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞株,然后利用構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞株觀察利用sh RNA干擾技術(shù)使HK2基因表達(dá)水平降低與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231放射治療敏感性之間的關(guān)系。方法利用慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA(sh RNA)干擾技術(shù)設(shè)計(jì)3個(gè)沉默HK2的sh RNA基因序列(h-HK2 sh RNA1、h-HK2 sh RNA2、h-HK2 sh RNA3)以及一個(gè)陰性對照序列(Negative sh RNA),將3沉默序列及一個(gè)陰性對照序列分別與質(zhì)粒連接,然后轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞,將靶基因植入慢病毒載體,隨后轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞系,通過抗生素嘌呤霉素篩選獲得HK2低表達(dá)的乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞系。采用RT-PCR及western blotting方法分別從m RNA和蛋白水平檢測轉(zhuǎn)染后的沉默效果。篩選出沉默效果最佳的穩(wěn)定細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為3組:空白組(Control組,即不做任何處理),陰性對照組(Negative組,即轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組)以及沉默的實(shí)驗(yàn)組(HK2 sh RNA組,即轉(zhuǎn)染穩(wěn)定沉默HK2基因質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組)。1、將上述三組不同的細(xì)胞分別置于0、2、4、6、8Gy劑量的X線下照射,通過CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察三組細(xì)胞在上述不同劑量下的細(xì)胞增值情況。2、將上述三組細(xì)胞在6Gy劑量的X線下照射,然后利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測三組細(xì)胞在6 Gy X線照射下細(xì)胞的凋亡情況。以此來判斷沉默HK2與乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231放射治療敏感性之間的關(guān)系。結(jié)果1、成功構(gòu)建帶有沉默HK2基因序列p HBLV-U6-Scramble-Zs Green-Puro的質(zhì)粒。2、RT-PCR及western blot結(jié)果顯示:三個(gè)沉默HK2的序列中,h-HK2-sh RNA1基因序列沉默的效果最好,沉默后HK2的m RNA相對表達(dá)量下降了89%。3、三組細(xì)胞分別在0、2、4、6、8Gy的X線照射后,三組細(xì)胞的存活率在同一個(gè)劑量下h-HK2-sh RNA1組要明顯低于Control組和Negative組(P0.05);并且,隨著照射劑量的逐漸增高,三組細(xì)胞的存活率也逐漸下降,且h-HK2-sh RNA1組下降的幅度更大。4、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:三組細(xì)胞在6Gy的X線照射下,凋亡率分別為Control組(29.1%),Negative組(29.4%)和h-HK2-sh RNA1組(59.9%),可以看出h-HK2-sh RNA1組的細(xì)胞凋亡率明顯高于其余兩組,且P0.05。結(jié)論利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)有效的降低的乳腺癌細(xì)胞中HK2的表達(dá)水平,并成功的構(gòu)建了帶有沉默HK2基因序列的質(zhì)粒,進(jìn)而感染乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞株,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HK2的乳腺癌細(xì)胞株。通過放射治療后,沉默細(xì)胞組增值率明顯下降,凋亡率明顯升高,說明HK2與乳腺癌的放療敏感性有關(guān),沉默HK2可增加乳腺癌對放射治療的敏感性。
[Abstract]:Objective to investigate whether short hairpin RNA (sh RNA) mediated hexokinase 2 (hexokinase 2 HK2) gene silencing has an effect on the radiosensitivity and the effect of radiotherapy on breast cancer cells. A stable breast cancer MDA-MB231 cell line with low expression of hexokinase 2 (HK2) was constructed by lentivirus-mediated RNA interference technique. Then the relationship between the expression of HK2 gene and the sensitivity of breast cancer cell line to MDA-MB231 radiotherapy was observed by using sh RNA interference technique. Methods using lentivirus mediated short hairpin RNA (sh RNA) interference technique, three shRNA sequences (h-HK2 sh RNA1h-HK2 sh RNA2h-HK2sh RNA3) of silencing HK2 and one negative control sequence (Negative sh RNA), were designed to connect with the plasmids, respectively. Then human 293T cells were transfected and the target gene was implanted into the lentivirus vector. Then the breast cancer MDA-MB231 cell line was transfected with the target gene. The low expression HK2 MDA-MB231 cell line was obtained by antibiotic purine mycin screening. The silencing effect of transfection was detected by RT-PCR and western blotting from m RNA and protein levels, respectively. The stable cell lines with the best silencing effect were selected for further experiment. The following experiments were divided into three groups: blank group (Control group, that is, without any treatment), negative control group (Negative group, that is, transfection negative plasmid group) and silent experimental group (HK2 sh RNA group). The experimental group transfected with stable silencing HK2 gene plasmids). The proliferation of three groups of cells at different doses was observed by CCK-8 assay. The above three groups of cells were irradiated under the X-ray of 6Gy dose, and then the apoptosis of the three groups was detected by flow cytometry (FCM) under 6 Gy X-ray irradiation. In order to determine the relationship between silent HK2 and breast cancer cell MDA-MB231 radiotherapy sensitivity. Results 1. The results of RT-PCR and western blot showed that among the three sequences of silencing HK2, the silencing of h-HK2-sh RNA1 gene sequence was the best. The relative expression of m RNA in HK2 decreased 89% after silencing. The survival rate of h-HK2-sh RNA1 group was significantly lower than that of Control group and Negative group (P0.05), and the survival rate of the three groups was significantly lower than that of Control group and Negative group at the same dose (P0.05), and the cell survival rate of the three groups was significantly lower than that of Control group and Negative group (P0.05), and the survival rate of the three groups was significantly lower than that of Control group and Negative group (P0.05). The survival rate of the three groups also decreased gradually, and that of the h-HK2-sh RNA1 group was much larger. The results of flow cytometry showed that the three groups of cells were exposed to 6Gy X ray irradiation. The apoptotic rates of Control group (29.1%) and h-HK2-sh RNA1 group (29.4%) were significantly higher than those of the other two groups (P 0.05). Conclusion Lentivirus mediated RNA interference technique can effectively reduce the expression of HK2 in breast cancer cells, and successfully construct a plasmid with silencing HK2 gene sequence, and then infect breast cancer MDA-MB231 cell line. Breast cancer cell lines stably transfected with HK2 were obtained. After radiotherapy, the proliferation rate and apoptosis rate in silencing group decreased significantly, indicating that HK2 was related to the radiosensitivity of breast cancer, and silencing HK2 could increase the sensitivity of breast cancer to radiotherapy.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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