本文關(guān)鍵詞：PHII-7體外抑制腫瘤侵襲遷移作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》 2014年

PHII-7體外抑制腫瘤侵襲遷移作用機(jī)制研究

高雪  

【摘要】：背景：腫瘤侵襲遷移是惡性腫瘤的主要特征之一,也是導(dǎo)致腫瘤治療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)和病人死亡的主要原因之一,但是目前針對(duì)腫瘤侵襲遷移仍無有效的治療方法。中藥當(dāng)歸龍薈丸用于治療慢性粒細(xì)胞性白血病有較好的療效,其活性成分靛玉紅有顯著的抗腫瘤活性。本室以靛玉紅的分子結(jié)構(gòu)為模板,設(shè)計(jì)、合成并篩選出一種有較高抗腫瘤活性、較低毒性的衍生物,將其命名為PHII-7。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),PHII-7呈現(xiàn)良好的廣譜抗腫瘤活性,對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株k562和k562/A02(k562多藥耐藥細(xì)胞株),人急性早幼粒細(xì)胞株HL60和HL60/ADR (HL60多藥耐藥細(xì)胞株),人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MCF-7/ADR (MCF-7多藥耐藥細(xì)胞株)等有明顯細(xì)胞生長抑制作用。本文主要探究PHII-7體外對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的作用及其作用機(jī)制。 方法：本文以3株高侵襲遷移細(xì)胞株MDA-MB-231(人乳腺癌細(xì)胞株),MCF-7/ADR(人乳腺癌MCF-7多藥耐藥細(xì)胞株)和A549(人肺腺癌細(xì)胞株)作為研究對(duì)象,對(duì)PHII-7體外抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移作用及作用機(jī)制進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)方法如下：通過MTT法對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測；通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞生長速率；通過細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞克隆形成能力和增殖能力；通過transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲遷移能力；通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和壞死情況；通過realtimePCR實(shí)驗(yàn)檢測基因mRNA水平表達(dá)；通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)檢測基因蛋白水平表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,用SPSS13.0軟件和Graphpad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果：首先,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCF-7/ADR細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞相比有較強(qiáng)的侵襲性和遷移性,其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(EMT)特征明顯,EMT標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)明顯降低,而Slug, β-catenin和vimentin表達(dá)明顯增強(qiáng)。其次,PHII-7在低濃度條件下能有效地抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移,且呈明顯的濃度依賴性。PHII-7在高濃度條件下能有效地抑制細(xì)胞增殖和集落形成,對(duì)細(xì)胞生長抑制呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。PHII-7能誘導(dǎo)高侵襲遷移性細(xì)胞凋亡,主要是通過激活凋亡相關(guān)經(jīng)典信號(hào)通路caspase家族實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),PHII-7抑制侵襲遷移作用機(jī)制與EMT過程有關(guān),PHII-7作用侵襲遷移性腫瘤細(xì)胞能有效增強(qiáng)其上皮細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá),降低間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá),其中包括EMT標(biāo)記基因E-cadherin, Slug, β-catenin和vimentin,表明PHII-7抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移主要通過調(diào)控EMT相關(guān)基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)。 結(jié)論：藥物治療一直是臨床常用的腫瘤治療手段,但其毒副作用較大。目前急需加快抗腫瘤藥物研發(fā),完善臨床治療策略。PHII-7是一種有研究價(jià)值的抗腫瘤衍生物,PHII-7不僅能增強(qiáng)耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性,抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移,體內(nèi)外對(duì)腫瘤細(xì)胞生長也有顯著的抑制作用。對(duì)PHII-7抗腫瘤作用機(jī)制的研究為研發(fā)低毒高效的抗腫瘤藥物、臨床輔助治療藥物和分子靶向藥物提供重要數(shù)據(jù)。 背景：近年來抗腫瘤藥物發(fā)展迅速,尤其是針對(duì)有效靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物。PHII-7是以傳統(tǒng)中藥當(dāng)歸龍薈丸的活性成分靛玉紅為模板設(shè)計(jì)、合成的抗腫瘤衍生物。PHII-7體外有良好的廣譜抗腫瘤活性,能明顯抑制多種腫瘤細(xì)胞和耐藥細(xì)胞生長,但PHII-7具體作用機(jī)制仍不明確。實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)PHII-7的抗腫瘤作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究,利用化學(xué)修飾和蛋白組學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn),PHII-7氨烷基側(cè)鏈衍生物體外可以與k562細(xì)胞裂解物中的α-烯醇化酶(ENO1)結(jié)合。為進(jìn)一步探究PHII-7與其特異性結(jié)合的靶蛋白ENO1的關(guān)系,前期構(gòu)建和篩選了穩(wěn)定干擾ENO1的k562細(xì)胞系k562-shENO1及其對(duì)照細(xì)胞系k562-shC()N,本文對(duì)穩(wěn)定干擾ENO1細(xì)胞株進(jìn)行了鑒定,旨在探究PHII-7作用機(jī)制及干擾ENO1后對(duì)PHII-7作用的影響。 方法：本文以2株穩(wěn)定干擾細(xì)胞株k562-shCON和k562-shENO1作為研究對(duì)象,對(duì)PHII-7體外作用機(jī)制進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)方法如下：通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；通過MTT法對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測；通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞生長曲線；通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和壞死情況；通過甲基纖維素半固體集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力；通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞群中干細(xì)胞比例；通過realtimePCR實(shí)驗(yàn)檢測基因mRNA水平表達(dá)；通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)檢測基因蛋白水平表達(dá)；通過動(dòng)物體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞生長和干性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,用SPSS13.0軟件和Graphpad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果：穩(wěn)定干擾細(xì)胞株k562-shCON和k562-shENO1與k562細(xì)胞相比,形態(tài)無明顯改變,細(xì)胞生長為正常懸浮狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定干擾ENO1后,k562細(xì)胞對(duì)PHII-7抑制細(xì)胞增殖作用更為敏感。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定干擾細(xì)胞株k562-shCON和k562-shENO1生長速率無明顯差異,但k562-shENO1對(duì)低濃度PHII-7抑制生長作用更敏感。PHII-7能誘導(dǎo)k562-shCON細(xì)胞和k562-shENO1細(xì)胞凋亡,主要通過激活凋亡相關(guān)經(jīng)典信號(hào)途徑caspase家族實(shí)現(xiàn)。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PHII-7能誘導(dǎo)k562-shCON細(xì)胞核和k562-shENO1細(xì)胞核裂解,且k562-shENO1細(xì)胞核裂解更明顯。動(dòng)物體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),k562-shCON實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤全部形成,且瘤體積較大；k562-shENO1實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤形成比例較小,且瘤體積較小。 結(jié)論：通過化學(xué)修飾和蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法發(fā)現(xiàn),PHII-7體外能與ENO1結(jié)合。通過進(jìn)一步體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在k562細(xì)胞內(nèi)干擾ENO1表達(dá),能顯著增強(qiáng)PHII-7對(duì)細(xì)胞的殺傷作用,表明PHII-7在細(xì)胞內(nèi)的作用可能首先是通過抑制或影響ENO1功能實(shí)現(xiàn),但PHII-7作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)還需進(jìn)一步研究。對(duì)PHII-7作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)的研究,將為新型抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)和研發(fā)提供重要的數(shù)據(jù),并有利于對(duì)傳統(tǒng)抗腫瘤藥物當(dāng)歸龍薈丸的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用。 背景：藥物治療是臨床腫瘤治療常用方法之一,目前部分抗腫瘤藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象,如乳腺癌常用抗腫瘤藥物他莫昔芬。腫瘤耐藥的產(chǎn)生是腫瘤治療失敗的主要原因之一,也是腫瘤臨床治療的難題。研究表明,α烯醇化酶(ENO1)與腫瘤細(xì)胞耐藥產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān),耐藥腫瘤細(xì)胞中ENO1常呈異常表達(dá)狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究ENO1在人慢性粒細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株k562/A02中的作用。方法：通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,將pSilencer U6-shCON質(zhì)粒和pSilencer U6-shEN01質(zhì)粒轉(zhuǎn)入k562/A02細(xì)胞中,利用篩選標(biāo)記潮霉素進(jìn)行篩選和單克隆細(xì)胞培養(yǎng),構(gòu)建穩(wěn)定干擾ENO1的k562/A02-shENO1細(xì)胞株和對(duì)照k562/A02-shCON細(xì)胞株；通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；通過MTT法對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測；通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞生長曲線；通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和壞死情況;通過甲基纖維素半固體集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力；通過realtime PCR實(shí)驗(yàn)檢測基因mRNA水平表達(dá)；通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)檢測基因蛋白水平表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,用SPSS13.0軟件和Graphpad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果：與敏感性細(xì)胞株k562相比,ENO1在耐藥細(xì)胞株k562/A02表達(dá)增高,其在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)分別增高(2.85±0.56)倍和(1.43±0.05)倍。k562/A02細(xì)胞生長速率與k562細(xì)胞相比無顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)成功篩選3株穩(wěn)定干擾ENO1的細(xì)胞株k562/A02-shENO1和對(duì)照細(xì)胞系k562/A02-shCON。3株k562/A02-shENO.1細(xì)胞與對(duì)照組k562/A02-shCON細(xì)胞相比生長速率均降低,對(duì)抗腫瘤藥物紫杉醇和阿霉素的敏感性均增強(qiáng)。k562/A02-shENO1細(xì)胞對(duì)羅丹明123蓄積能力與對(duì)照組相比顯著性增強(qiáng),同時(shí)k562/A02-shENO1細(xì)胞中耐藥相關(guān)基因MDR1表達(dá)水平在mRNA水平和蛋白水平均降低。甲基纖維素半固體集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),k562/A02-shENO1細(xì)胞中細(xì)胞克隆能力明顯降低。 結(jié)論：穩(wěn)定干擾ENO1表達(dá)不僅能抑制k562/A02細(xì)胞生長和降低細(xì)胞群中干細(xì)胞比例,還能增強(qiáng)k562/A02細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物敏感性,降低其MDRl基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明,ENO1與k562/A02細(xì)胞耐藥基因表達(dá)相關(guān),ENO1可以作為k562/A02細(xì)胞克服耐藥的靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

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5 綦淑芬;萬瑞香;姚如勇;;扇貝多肽對(duì)Hela細(xì)胞在紫外線損傷下的保護(hù)作用[A];第五屆全國自由基生物學(xué)與自由基醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編[C];2000年

6 余珂;王敬賢;周炳升;;多溴聯(lián)苯醚誘導(dǎo)人神經(jīng)SK-N-SH細(xì)胞調(diào)亡的機(jī)理[A];湖北省暨武漢市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)第八屆第十七次學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2007年

7 吳李君;裴蓓;王順昌;王軍;湯明禮;;砷和鎘暴露誘導(dǎo)秀麗小桿線蟲生殖腺細(xì)胞調(diào)亡及其信號(hào)通路研究[A];中國毒理學(xué)會(huì)第二屆全國中青年學(xué)者科技論壇會(huì)議論文集[C];2007年

8 冉新澤;鄭懷恩;王艾平;王鋒超;韓京;;他汀對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞輻射損傷組織因子與細(xì)胞調(diào)亡的影響[A];中國毒理學(xué)會(huì)放射毒理專業(yè)委員會(huì)第七次、中國毒理學(xué)會(huì)免疫毒理專業(yè)委員會(huì)第五次、中國環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)致突專業(yè)委員會(huì)第二次、中國環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)致畸專業(yè)委員會(huì)第二次、中國環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)致癌專業(yè)委員會(huì)第二次全國學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

9 崔承彬;閆少羽;蔡兵;趙慶春;姚新生;曲戈霞;;黑果黃皮Clausena dunniana Levl中咔唑生物堿類新細(xì)胞周期抑制劑及細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)劑的核磁共振研究[A];第十一屆全國波譜學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2000年

10 吳耀輝;鄒萍;;Sunrivin基因沉默對(duì)K562細(xì)胞調(diào)亡影響的研究[A];第11次中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文匯編[C];2007年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張?zhí)锟?[N];中國人口報(bào);2002年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 朱海燕;熱休克蛋白60在凋亡細(xì)胞和大腸桿菌的表面表達(dá)及意義研究[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

2 劉瀾濤;輻射誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型改變及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制的初步研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2013年

3 秦勇;細(xì)胞內(nèi)ROS水平改變對(duì)細(xì)胞活性及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的影響[D];浙江大學(xué);2012年

4 龔平生;RNA干擾survivin基因表達(dá)增強(qiáng)HeLa細(xì)胞電離輻射敏感性的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2008年

5 王鵬;RING結(jié)構(gòu)泛素連接酶RNF186的功能研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

6 李覃;微囊藻毒素LR刺激HEK293細(xì)胞產(chǎn)生的PP2A調(diào)節(jié)機(jī)制及其對(duì)細(xì)胞凋亡命運(yùn)的影響[D];浙江大學(xué);2013年

7 畢嘉成;NK細(xì)胞抑制性受體TIGIT的功能研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2014年

8 王明明;AT細(xì)胞輻射敏感性的研究[D];蘇州大學(xué);2004年

9 吳康妮;Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)人急性髓系白血病細(xì)胞的殺傷作用及機(jī)理研究[D];浙江大學(xué);2013年

10 張晶晶;基于碳納米管的腫瘤細(xì)胞電化學(xué)傳感及凋亡研究[D];南京大學(xué);2010年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳晶晶;TIP30感受細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)p53依賴的細(xì)胞凋亡機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2008年

2 李詠;蘋果酸、γ-氨基丁酸對(duì)Hela細(xì)胞端粒酶活性影響的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

3 余志堅(jiān);P糖蛋白對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞輻射敏感性負(fù)調(diào)控機(jī)制的初步研究[D];中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);2003年

4 孫毅;亞硒酸鈉抑制K562細(xì)胞的生長及誘導(dǎo)其凋亡的探討[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

5 黃風(fēng)迎;細(xì)胞松馳素D聚乙二醇脂質(zhì)體抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)研究[D];海南大學(xué);2012年

6 聶建增;家蠅蛹凝集素對(duì)HepG2細(xì)胞的抗腫瘤作用及機(jī)理研究[D];天津科技大學(xué);2012年

7 楊超;雞NK細(xì)胞的分離鑒定及靶細(xì)胞篩選[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

8 吳云霞;光動(dòng)力學(xué)療法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制的初步研究[D];華南師范大學(xué);2005年

9 彭坤;二甲基亞砜抑制培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究[D];武漢大學(xué);2004年

10 殷楚云;急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1側(cè)群細(xì)胞的分選、鑒定與富集[D];鄭州大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：PHII-7體外抑制腫瘤侵襲遷移作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：214615