發(fā)布時間：2018-07-15 22:17

【摘要】：肝細(xì)胞癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是全球發(fā)病率排名第五的一種常見惡性腫瘤,每年超過五十萬人死于HCC,它也是世界上死亡發(fā)生率位列癌癥第三的腫瘤,嚴(yán)重威脅著人們的身體健康。流行病學(xué)及實(shí)驗(yàn)研究資料表明,HCC與許多危險因素密切相關(guān),包括慢性乙型肝炎病毒和慢性丙型肝炎病毒感染、酗酒、亞硝胺類物質(zhì)、黃曲霉素、肝硬化、飲水污染、微量元素、性激素等都與HCC發(fā)病明顯相關(guān)。由于HCC發(fā)生的分子機(jī)制尚不完全清楚,盡管臨床檢測方法和治療手段不斷的改進(jìn)與發(fā)展,但是化療及術(shù)后HCC患者的預(yù)后仍然很差,復(fù)發(fā)率高,其中有許多影響預(yù)后的相關(guān)因素,包括腫瘤大小,腫瘤數(shù)量,細(xì)胞分化,對靜脈血管侵襲及炎癥程度等。惡性腫瘤是在多個危險因素的共同作用下,導(dǎo)致人體組織細(xì)胞分裂、增生、凋亡等調(diào)控異常而形成的一種新生物�；蚪M表達(dá)的不穩(wěn)定性是惡性腫瘤發(fā)病的基本特征之一,基因組的缺失或擴(kuò)增常常在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn),這些基因組的改變可導(dǎo)致抑癌基因的失活或癌基因的激活,使人體細(xì)胞出現(xiàn)重大的改變。大約有50%的微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)基因位于與惡性腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)或基因組區(qū)域,它們和正常人體組織細(xì)胞miRNA的表達(dá)有明顯差異,不同組織來源的腫瘤細(xì)胞系中的miRNA的調(diào)控作用及含量也會明顯不同。miRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類由22個核苷酸組成,可以通過與信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)3′非編碼區(qū)(3'-untranslated region,3'UTR)堿基互補(bǔ)結(jié)合,導(dǎo)致其目的蛋白翻譯受到抑制,發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)器的作用。具體來說,miRNA的目標(biāo)核苷酸位于mRNA的5'端,也被稱為mRNA 3'UTR的種子區(qū)域。miRNA與其相應(yīng)mRNA序列的互補(bǔ)結(jié)合導(dǎo)致mRNA沉默并進(jìn)而促使目的蛋白表達(dá)水平的下降,可以影響細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程。miRNA是一個細(xì)胞功能和細(xì)胞程序的調(diào)控閥門,不僅能調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的表達(dá),還能影響多個信號通路的信號傳導(dǎo),對惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程具有調(diào)控樞紐作用。近年來許多學(xué)者越來越重視mirna相關(guān)等位基因單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,snps)的研究。snps是指單個核苷酸在染色體水平上變異而引起的基因組序列多態(tài)性,這些變異包括核苷酸的置換、缺失和插入等改變。snps廣泛存在于人類基因組中,平均每500~1000個堿基就會出現(xiàn)一個,占所有已知基因多態(tài)性類型的90%以上,是人類最常見的一種可遺傳變異。隨著對人類全基因組大規(guī)模掃描結(jié)果顯示,mirna結(jié)合位點(diǎn)上的snps約有20000個。它既具有遺傳標(biāo)記作用,還可以通過調(diào)控基因表達(dá)導(dǎo)致疾病易感性的差異。越來越多的證據(jù)表明,位于3'utr的mirna結(jié)合位點(diǎn)snps可以通過mirna改變目的基因的表達(dá),從而增加個體罹患癌癥的風(fēng)險。mirna及其結(jié)合位點(diǎn)snps對hcc的發(fā)病易感性,腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,疾病的自然轉(zhuǎn)歸及術(shù)后預(yù)后有明顯的影響,而且部分snps可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖,對機(jī)體有保護(hù)作用。mirna結(jié)合位點(diǎn)snps分析可以幫助我們確定hcc患者亞組中的發(fā)病風(fēng)險和治療預(yù)后。為此,本實(shí)驗(yàn)將篩選hcc患者位于靶基因3′utr的4個mirna結(jié)合位點(diǎn)snps,包括蘭尼堿受體3(ryanodinereceptor3,ryr3)(rs1044129),c14orf101(rs4901706),kiaa0423(rs1053667)和golga7(rs11337),了解它們與hcc患病風(fēng)險和預(yù)后的關(guān)系,評估其在hcc患者發(fā)生發(fā)展中的作用。第一部分肝細(xì)胞癌患者microrna結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的篩選與鑒定目的:本實(shí)驗(yàn)擬結(jié)合文獻(xiàn),并通過ncbidbsnp數(shù)據(jù)庫公布的3'utrmirna結(jié)合位點(diǎn)snps,篩選出可能影響hcc患者發(fā)病及預(yù)后的基因位點(diǎn),為hcc的精準(zhǔn)治療奠定良好的基礎(chǔ)。方法:1)收集從2008年1月到2010年12月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肝膽外科連續(xù)95例接受hcc切除術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)的hcc患者的血液樣本。對照組:選擇同期在我院體檢中心查體的90例無癌癥病史的健康對照血液標(biāo)本。所有實(shí)驗(yàn)均獲得所有患者同意并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會監(jiān)督批準(zhǔn)。2)收集上述hcc患者的臨床資料。臨床數(shù)據(jù)包括性別、年齡、child-pugh分級、門靜脈瘤栓是否形成、腫瘤數(shù)量、腫瘤直徑和tnm分期等。對hcc術(shù)后患者通過電話對其隨訪,如病重或死亡則對其家屬進(jìn)行隨訪,以了解患者生存情況,隨訪時間為3年。3)統(tǒng)計上述臨床資料hcc患者術(shù)后3年存活率之間的差異,并統(tǒng)計出可能影響生存率的相關(guān)因素。應(yīng)用dna純化試劑盒對hcc患者全血基因組dna進(jìn)行提取并提純。根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫查找到的上述4個mirna結(jié)合位點(diǎn)snps相應(yīng)的核苷酸序列,設(shè)計出pcr擴(kuò)增所需上下游引物,并按照pcrmastermixkit流程擴(kuò)增上述基因,采用snapshot方法鑒定各snps基因型。4)統(tǒng)計學(xué)方法:對hcc組和正常對照組的性別、年齡等計量資料進(jìn)行比較均采用t檢驗(yàn)(studentt-test),分析hcc和對照組snp分布頻率采用χ2檢驗(yàn)(pearsonchi-squaretest)進(jìn)行分析,估計組間生存率和繪制累計生存函數(shù)曲線采用kaplan-meier方法,檢驗(yàn)各組生存曲線分布的異同,比較生存率有無差別應(yīng)用log-rank方法,多因素生存分析采用cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行。不同組間比較均采用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均應(yīng)用spss18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,p0.05表示差異有顯著性。結(jié)果:1)研究對象:對hcc組與對照組的年齡、性別進(jìn)行比較,結(jié)果顯示兩組年齡(58.74±12.58vs56.83±9.80,p=0.853)、性別(84/11vs81/9,p=0.730)均衡可比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各臨床特征的術(shù)后3年生存率如下:男性vs女性(31.6%vs22.2%,p=0.530),年齡≤60歲vs60歲(28.8%vs34.5%,p=0.742),child-pugh分級a級vsb級(32.9%vs0%,p=0.019),門靜脈瘤栓形成vs無瘤栓形成(32.5%vs12.5%,p=0.027),腫瘤直徑(單位厘米)≤5vs5(35.7%vs28.3%,p=0.765),tnm分期0~ⅠvsⅡ~Ⅲ(46.7%vs22.4%,p=0.017),單發(fā)腫瘤vs多發(fā)腫瘤(30.9%vs30.0%,p=0.871)。2)mirna結(jié)合位點(diǎn)snp分布頻率分析:對hcc組和正常對照組的4個mirna結(jié)合位點(diǎn)snps分布頻率分析顯示,所有4個snps,rs1044129、rs4901706、rs1053667、rs11337,分布頻率均無顯著性差異,說明實(shí)驗(yàn)所篩選各snp位點(diǎn)可能都與hcc發(fā)病無明顯相關(guān)。3)生存分析:分析hcc患者術(shù)后3年生存率結(jié)果顯示,ryr3基因結(jié)合位點(diǎn)rs1044129,aa基因型vsag+gg(39.4%vs25.5%,p=0.047);c14orf101基因結(jié)合位點(diǎn)rs4901706,gg基因型vsaa+ag(27.1%vs35.0%,p=0.573);kiaa0423基因結(jié)合位點(diǎn)rs1053667,tt基因型vsct+cc(32.8%vs26.7%,p=0.717);golga7基因結(jié)合位點(diǎn)rs11337,gg基因型vsgt+tt(30.8%vs30.6%,p=0.594)。我們應(yīng)用cox比例風(fēng)險模型對這些預(yù)測因素進(jìn)行了多變量分析,結(jié)果顯示,ryr3相對危險度為1.812(95%可信區(qū)間:1.026~3.201,p=0.041),child-pugh分級相對危險度為2.464(95%可信區(qū)間:1.020~5.951,p=0.045),tnm分期相對危險度為1.922(95%可信區(qū)間:1.037~3.562,p=0.038),門靜脈瘤栓形成相對危險度為1.571(95%可信區(qū)間:0.664~3.719,p=0.304)。第二部分ryr3基因microrna結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與術(shù)后hcc患者預(yù)后的關(guān)系目的:本部分研究,我們將對位于3′utrryr3基因mirna結(jié)合位點(diǎn)rs1044129各基因型在hcc患者組織中的表達(dá)進(jìn)行分析,并且通過hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染目的基因了解其對癌細(xì)胞活性的影響,以此評估rs1044129與hcc預(yù)后的關(guān)系。方法:1)對象來源:病例組選擇88例接受原發(fā)性肝癌切除術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)的hcc患者。對照組選擇45例同時期因肝臟海綿狀血管瘤、肝內(nèi)膽管結(jié)石以及其它肝臟良性疾病進(jìn)行手術(shù)治療的患者,留取各試驗(yàn)組肝臟組織。2)hcc患者全血基因組dna提取,目的基因pcr擴(kuò)增及基因型分析,同第一部分。3)免疫組織化學(xué)方法檢測ryr3在肝臟組織的定位表達(dá),應(yīng)用組織化學(xué)評分方法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定。4)根據(jù)ryr3的核苷酸序列設(shè)計出含有aa或gg基因型的2條寡核苷酸鏈的正義,反義引物鏈,構(gòu)建質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞,應(yīng)用psichecktm-2載體檢測轉(zhuǎn)染ryr3基因?qū)ela細(xì)胞系細(xì)胞活性的影響。5)統(tǒng)計學(xué)方法:分析ryr3組各基因型在hcc組織表達(dá)情況采用χ2檢驗(yàn),采用kaplan-meier檢驗(yàn)比較ryr3低表達(dá)與高表達(dá)hcc患者的術(shù)后生存率,采用t檢驗(yàn)比較組間不同的熒光素酶基因表達(dá)水平。所有數(shù)據(jù)分析均使用spss18.0統(tǒng)計軟件包處理,p0.05表示差異有顯著性。結(jié)果:1)我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測了收集的88例hcc組織ryr3表達(dá)情況并計算相應(yīng)的組織化學(xué)評分。hcc患者ryr3(rs1044129)aa型低表達(dá)vs高表達(dá)(29例vs4例),ag型低表達(dá)vs高表達(dá)(8例vs33例),gg型低表達(dá)vs高表達(dá)(3例vs11例)。χ2檢驗(yàn)顯示,ryr3aa基因型的hcc患者,比ag和gg型患者表達(dá)水平更低,與二者比較均有顯著性差異(p=0.001)。2)hcc肝組織ryr3(rs1044129)低表達(dá)患者人數(shù)vs高表達(dá)(40例vs48例),術(shù)后3年生存率低表達(dá)患者vs高表達(dá)(54.91vs27.45,p=0.032)。3)應(yīng)用含有aa或gg基因型寡核苷酸鏈的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞后,我們觀察到海腎熒光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性比aa基因型vsgg(1.61±0.09vs2.01±0.14,p=0.019)。第三部分ryr3基因microrna結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性對人肝癌細(xì)胞系smmc-7721細(xì)胞功能的影響目的:本部分應(yīng)用人肝癌細(xì)胞系smmc-7721作為研究對象,采用小干擾rna技術(shù)沉默ryr3在肝細(xì)胞癌smmc-7721細(xì)胞中的表達(dá),觀察轉(zhuǎn)染ryr3sirna后肝細(xì)胞癌smmc-7721細(xì)胞增殖與凋亡的變化,了解位于ryr3基因mirna結(jié)合位點(diǎn)rs1044129對肝癌細(xì)胞功能的影響,以此證實(shí)其對hcc患者預(yù)后的影響。方法:1)我們以psi-u6為載體構(gòu)建ryr3敲低質(zhì)粒,合成4對候選ryr3-shrna和1對陰性對照nc-shrna。制備感受態(tài)大腸埃希菌,并進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及提取,應(yīng)用質(zhì)粒和lipofectamine2000混合液轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系smmc-7721細(xì)胞,經(jīng)過培養(yǎng)后倒置顯微鏡下觀察到培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光,證明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組,正常對照組(blank-control),陰性對照轉(zhuǎn)染組(control-sirna/lipofactamine2000)和實(shí)驗(yàn)組(ryr3-sirna/lipofactamine2000)。2)westernblot方法篩選出ryr3沉默最佳的人肝癌細(xì)胞系smmc-7721細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。3)mts法檢測轉(zhuǎn)染ryr3基因后對人肝癌細(xì)胞系smmc-7721細(xì)胞增殖的影響。4)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染ryr3基因后對人肝癌細(xì)胞系smmc-7721細(xì)胞凋亡的影響。5)統(tǒng)計學(xué)方法:評估blank-control和control-sirna與ryr3轉(zhuǎn)染組的差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),所有數(shù)據(jù)分析均使用spss18.0統(tǒng)計軟件包處理,p0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系smmc-7721細(xì)胞后,培養(yǎng)48h后通過倒置熒光顯微鏡在激發(fā)波長480nm條件下檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞,鏡下可見肝癌細(xì)胞表達(dá)gfp綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率達(dá)到91%。2)應(yīng)用westernblot檢測smmc-7721細(xì)胞結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染48h后,sirna-1,sirna-2,sirna-3和sirna-4均有效降低smmc-7721細(xì)胞內(nèi)源ryr3蛋白的表達(dá)水平,與對照組相比分別降低了48.6%、54.7%、36.9%和38.2%。因此,選取沉默最佳的sirna-2用于后續(xù)的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。3)應(yīng)用mts法檢測人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染RYR3-siRNA基因后0 h,12 h,24 h,36 h,48 h,60 h,72 h的吸光值(OD)。研究結(jié)果顯示,RYR3-siRNA組的OD值分別為0.867±0.010、1.184±0.059、1.441±0.082、1.659±0.102、1.744±0.065、1.862±0.033、1.998±0.093;Control-siRNA組分別為0.868±0.080、1.327±0.052、1.837±0.076、2.220±0.138、2.449±0.072、2.535±0.035、2.613±0.176;Blank-control組0.863±0.107、1.568±0.131、1.919±0.059、2.554±0.082、2.715±0.078、2.804±0.112、2.986±0.086。在各觀察時段SMMC-7721細(xì)胞生長均出現(xiàn)不同程度的抑制,且抑制率隨轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時間的延長而增加,各時間段比較有顯著性差異,且與Control-siRNA組和Blank-control組也有顯著性差異(P0.05)。4)轉(zhuǎn)染RYR3對人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響:通過流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞凋亡率可見,轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞RYR3-siRNA組凋亡率為39.010±1.677,Control-siRNA組為12.379±1.075,Blank-control組為5.373±0.456,RYR3-siRNA組凋亡率與其余2組凋亡率相比明顯下降,結(jié)果均有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:1)篩選與HCC術(shù)后三年生存率相關(guān)的臨床特征和4個miRNA結(jié)合位點(diǎn)SNPs發(fā)現(xiàn),Child-Pugh分級、TNM分期、RYR3(rs1044129)與HCC術(shù)后3年生存率明顯相關(guān)。2)HCC患者rs1044129 AA型肝組織中RYR3表達(dá)較其它類型減少最為明顯,RYR3低表達(dá)患者生存時間比高表達(dá)患者明顯延長,RYR3轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后其細(xì)胞活性AA型比GG型降低更為明顯。3)RYR3(rs1044129)沉默可抑制SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡�？傊�,本課題研究表明,位于3'UTR的RYR3 miRNA結(jié)合位點(diǎn)rs1044129 SNP通過影響miRNA與RYR3的結(jié)合力而影響RYR3表達(dá),繼而RYR3通過對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響來調(diào)控HCC預(yù)后,RYR3可以作為一個獨(dú)立的生物標(biāo)記物來預(yù)測HCC的預(yù)后。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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