發(fā)布時(shí)間：2018-07-15 22:40

【摘要】：卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在卵巢癌中,最為常見(jiàn)的病理類(lèi)型是上皮性卵巢癌。在發(fā)達(dá)國(guó)家,上皮性卵巢癌是致死率最高的婦科腫瘤,超過(guò)70%的婦女在被診斷時(shí)就已經(jīng)是晚期,而晚期卵巢癌的治愈率不高于30%。上皮性卵巢癌的治療效果不佳,與其在診斷之前腫瘤的早期侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。到目前為止,上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍然不完全清楚。所以尋找上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物,研究其轉(zhuǎn)移機(jī)制,一直是卵巢癌研究中的熱點(diǎn)。囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)是一個(gè)約170 kDa的糖蛋白,是一個(gè)環(huán)磷酸腺苷依賴的氯離子通道蛋白。CFTR分布于人類(lèi)各組織的上皮細(xì)胞,包括女性生殖道,通過(guò)調(diào)控離子和水分轉(zhuǎn)運(yùn),在維持和穩(wěn)定機(jī)體局部液體微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。CFTR是ABC (ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員,它們利用ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)底物通過(guò)細(xì)胞膜,這與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。CFTR的基因突變可以導(dǎo)致其在細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)功能的障礙,可能增加或減少一些惡性腫瘤患病風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明,CFTR與乳腺癌的上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。CFTR也與一些細(xì)胞炎癥和凋亡相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)。國(guó)內(nèi)外目前尚無(wú)CFTR在上皮性卵巢癌惡性生物學(xué)行為中的相關(guān)研究報(bào)道。因此,本課題將分為以下三部分對(duì)CFTR在上皮性卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其潛在的機(jī)制進(jìn)行初步研究。第一部分CFTR在人上皮性卵巢癌中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性目的：檢測(cè)人上皮性卵巢癌組織、良性卵巢組織及正常卵巢組織標(biāo)本中CFTR的蛋白表達(dá)情況,探討上皮性卵巢癌組織中CFTR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。方法：(1)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CFTR在83例上皮性卵巢癌組織標(biāo)本,18例良性腫瘤標(biāo)本和11例正常卵巢組織標(biāo)本中的表達(dá)情況。(2)分析CFTR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,CFTR在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)比良性卵巢腫瘤組(PO.05)以及正常卵巢組(P0.05)均明顯增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而良性卵巢腫瘤和正常卵巢組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在上皮性卵巢癌中,CFTR蛋白的表達(dá)水平在FIGO Ⅲ/Ⅳ期組織中顯著高于Ⅰ/Ⅱ期(P0.05),病理分級(jí)2-3級(jí)組織中的表達(dá)顯著高于1級(jí)(P0.05),血漿Ca-12535 U/ml的組織中表達(dá)顯著高于Ca-12535 U/ml的組織(P0.05),但與患者年齡、腫瘤大小、血漿HE4水平無(wú)關(guān)(P0.05)。在各個(gè)病理類(lèi)型中,漿液性囊腺癌中CFTR的表達(dá)水平比粘液性囊腺癌(P0.05)和子宮內(nèi)膜樣癌(P0.05)高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：在上皮性卵巢癌組織中CFTR高表達(dá)。高水平的CFTR與上皮性卵巢癌分期、腫瘤分化、血漿Ca-125值有關(guān),CFTR的高表達(dá)可能與臨床不良預(yù)后有關(guān)。卵巢漿液性囊腺癌組織中的CFTR表達(dá)水平比其他病理類(lèi)型高,這說(shuō)明CFTR可能在漿液性囊腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。第二部分CFTR基因特異性shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上皮性卵巢癌細(xì)胞株的篩選及人CFTR基因重組腺病毒的包裝及鑒定目的：應(yīng)用人CFTR基因特異性短發(fā)卡RNA (shRNA)真核質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞,通過(guò)嘌呤霉素篩選,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株,并檢測(cè)驗(yàn)證。構(gòu)建包含人CFTR基因的重組腺病毒真核表達(dá)載體,使用HEK293細(xì)胞包裝重組腺病毒。利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株和重組腺病毒,為后續(xù)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌法擴(kuò)增CFTR基因特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒,并酶切鑒定。將shRNA質(zhì)粒通過(guò)PolyJetTM轉(zhuǎn)染到A2780、 SKOV3細(xì)胞中,對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行嘌呤霉素加壓篩選,熒光顯微鏡觀察后,挑選克隆,擴(kuò)大培養(yǎng),直至建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。采用Western blot法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CFTR蛋白表達(dá)量的變化,驗(yàn)證和篩選CFTR基因抑制效應(yīng)最顯著的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。將目的片段人CFTR基因經(jīng)酶切、分離、純化,構(gòu)建pAdTrace-CFTR-TOX質(zhì)粒并酶切及測(cè)序鑒定。利用BJ5183細(xì)菌行質(zhì)粒pAdTrace-CFTR的同源重組,然后酶切及PCR法鑒定。將同源重組質(zhì)粒pAdTrace-CFTR線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,進(jìn)行病毒的包裝和擴(kuò)增。乒乓感染法制備高滴度Ad-CFTR腺病毒。Western blot檢測(cè)病毒感染后卵巢癌細(xì)胞CFTR蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：經(jīng)酶切驗(yàn)證,成功擴(kuò)增CFTR特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒。將CFTR-shRNA-1, CFTR-shRNA-2, CFTR-shRNA-3, CFTR-shRNA-4和陰性對(duì)照成功轉(zhuǎn)染A278、SKOV3細(xì)胞,嘌呤霉素霉素加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞株。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞克隆的GFP表達(dá),成功驗(yàn)證和篩選有均勻GFP熒光的細(xì)胞克隆。通過(guò)Western blot法檢測(cè)CFTR蛋白表達(dá),驗(yàn)證和篩選CFTR基因抑制效果最顯著的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上皮性卵巢癌細(xì)胞株A2780-CFTRi2和SKOV3-CFTRi3細(xì)胞。經(jīng)酶切后瓊脂糖電泳鑒定表明目的人CFTR基因分離成功。經(jīng)酶切后瓊脂糖電泳及基因測(cè)序表明重組質(zhì)粒pAdTrace-CFTR-TOX構(gòu)建成功。經(jīng)酶切后瓊脂糖電泳、PCR法檢測(cè)表明同源重組質(zhì)粒pAdTrace-CFTR構(gòu)建成功。經(jīng)熒光顯微鏡觀察HEK293細(xì)胞中的RFP表達(dá),表明Ad-CFTR腺病毒包裝及擴(kuò)增成功。熒光顯微鏡觀察Ad-CFTR腺病毒感染卵巢癌細(xì)胞效率,western blot分析表明腺病毒Ad-CFTR感染后細(xì)胞CFTR蛋白表達(dá)增加,說(shuō)明重組腺病毒Ad-CFTR構(gòu)建成功。結(jié)論：成功擴(kuò)增和鑒定了CFTR基因的特異性重組質(zhì)粒。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選成功獲得了CFTR基因抑制效果最顯著的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上皮性卵巢癌細(xì)胞株。成功構(gòu)建重組腺病毒真核表達(dá)載體pAdTrace-CFTR-TOX,利用pAdEasy系統(tǒng)成功包裝獲得過(guò)表達(dá)人CFTR基因的腺病毒,為進(jìn)一步研究CFTR惡性生物學(xué)行為及其分子機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。第三部分CFTR參與調(diào)節(jié)上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移行為及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究目的：探討CFTR對(duì)卵巢癌A2780、SKOV3細(xì)胞侵襲、遷移、增殖和粘附等一系列惡性生物學(xué)行為的影響及其可能分子機(jī)制。方法:Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CFTRi細(xì)胞的遷移、侵襲能力變化。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CFTR過(guò)表達(dá)細(xì)胞遷移能力的變化。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)分析CFTRi細(xì)胞的粘附能力改變。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定CFTRi細(xì)胞增殖能力改變。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察CFTRi細(xì)胞的克隆形成能力變化。裸鼠皮下移成瘤實(shí)驗(yàn)觀察CFTRi細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力變化,HE染色觀察裸鼠移植瘤組織形態(tài)學(xué)變化。重組腺病毒Ad-CFTR感染卵巢癌細(xì)胞A2780. SKOV3后,Western blot法檢測(cè)細(xì)胞src通路蛋白表達(dá)及其磷酸化形式的水平變化。結(jié)果：(1) Transwell、室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CFTRi細(xì)胞的遷移能力受到抑制。與對(duì)照組相比,約有63.11%的A2780-CFTRi細(xì)胞未能穿過(guò)基膜。而SKOV3-CFTRi細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比,遷移能力減少了41.72%。(2) Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CFTRi細(xì)胞的侵襲能力受到抑制。與對(duì)照組相比,約有63.93%的A2780-CFTRi細(xì)胞未能穿過(guò)基膜。而SKOV3-CFTRi細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比,侵襲能力減少了60.89%。(3)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Ad-CFTR感染后細(xì)胞遷移能力增加。A2780-Ad-CFTR組比對(duì)照組遷移能力增加了39.5%,同樣的,SKOV3-Ad-CFTR組遷移程度比對(duì)照組增加39.3%。(4)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)顯示,CFTRi細(xì)胞的粘附能力顯著降低。A2780-CFTRi細(xì)胞株粘附能力降低了約38.52%,而SKOV3-CFTRi粘附能力減少了42.31%。(5)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示出了CFTRi細(xì)胞增殖能力的降低。A2780-CFTRi和SKOV3-CFTRi細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比均表現(xiàn)出增殖能力的降低。(6)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,CFTRi表現(xiàn)出克隆形成能力的降低。A2780-CFTRi和SKOV3-CFTRi細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比均表現(xiàn)出克隆形成能力的降低。(7)裸鼠皮下移成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CFTRi細(xì)胞移植瘤瘤體生長(zhǎng)速度緩慢,體積減小,移植瘤重量減少。HE染色發(fā)現(xiàn)CFTRi組移植瘤細(xì)胞排列相對(duì)整齊。(8)各組細(xì)胞總的c-Src和磷酸化-Src419(Tyr419)表達(dá)量的變化均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CFTR過(guò)表達(dá)的組細(xì)胞表現(xiàn)出了磷酸化-Src530 (Tyr530)的激活。結(jié)論：CFTRi卵巢癌細(xì)胞表現(xiàn)出了細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力、增殖能力、克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力的顯著抑制,Ad-CFTR感染后細(xì)胞表現(xiàn)出了遷移能力的增加,從正反兩方面證實(shí)了CFTR在上皮性卵巢癌侵襲遷移、增殖、克隆形成等惡性生物學(xué)行為中的作用。在上皮性卵巢癌細(xì)胞中,上調(diào)的CFTR可能間接通過(guò)EBP50-Cbp-Csk影響到Tyr-527/530位點(diǎn)的磷酸化,從而影響侵襲、遷移等一系列惡性生物學(xué)行為。CFTR有可能是src信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路潛在的調(diào)節(jié)因子。
[Abstract]:Ovarian cancer is one of the most common malignant tumors in the female reproductive system . In the developed countries , the most common pathological type is epithelial ovarian cancer . In developed countries , epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecological tumor , and more than 70 % of them are involved in the development of ovarian cancer . The expression level of CFTR protein in ovarian serous cystadenocarcinoma was significantly higher than that in benign ovarian tumor group ( P0.05 ) . The expression of CFTR gene was successfully amplified and screened . The results showed that the expression of CFTR gene was successful . Compared with the control group , the ability of migration of CFTRi cells decreased by 39.3 % . Conclusion : CFTR may indirectly affect the invasion , proliferation and clonal formation of epithelial ovarian carcinoma . In the epithelial ovarian cancer cells , the up - regulated CFTR may indirectly affect the phosphorylation of Tyr - 527 / 530 sites by EBP50 - Cbp - Csk .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2125607