【摘要】：卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。在卵巢癌中,最為常見的病理類型是上皮性卵巢癌。在發(fā)達國家,上皮性卵巢癌是致死率最高的婦科腫瘤,超過70%的婦女在被診斷時就已經是晚期,而晚期卵巢癌的治愈率不高于30%。上皮性卵巢癌的治療效果不佳,與其在診斷之前腫瘤的早期侵襲和轉移有關。到目前為止,上皮性卵巢癌轉移的機制仍然不完全清楚。所以尋找上皮性卵巢癌轉移的分子標志物,研究其轉移機制,一直是卵巢癌研究中的熱點。囊性纖維化跨膜轉導因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)是一個約170 kDa的糖蛋白,是一個環(huán)磷酸腺苷依賴的氯離子通道蛋白。CFTR分布于人類各組織的上皮細胞,包括女性生殖道,通過調控離子和水分轉運,在維持和穩(wěn)定機體局部液體微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。CFTR是ABC (ATP-binding cassette)轉運蛋白家族的一員,它們利用ATP酶轉運底物通過細胞膜,這與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系。CFTR的基因突變可以導致其在細胞膜上轉運功能的障礙,可能增加或減少一些惡性腫瘤患病風險。有研究表明,CFTR與乳腺癌的上皮向間質轉化有關。CFTR也與一些細胞炎癥和凋亡相關的信號通路有關。國內外目前尚無CFTR在上皮性卵巢癌惡性生物學行為中的相關研究報道。因此,本課題將分為以下三部分對CFTR在上皮性卵巢癌侵襲轉移的作用及其潛在的機制進行初步研究。第一部分CFTR在人上皮性卵巢癌中的表達及與臨床病理參數的相關性目的：檢測人上皮性卵巢癌組織、良性卵巢組織及正常卵巢組織標本中CFTR的蛋白表達情況,探討上皮性卵巢癌組織中CFTR的表達與臨床病理參數之間的相關性。方法：(1)采用免疫組織化學法檢測CFTR在83例上皮性卵巢癌組織標本,18例良性腫瘤標本和11例正常卵巢組織標本中的表達情況。(2)分析CFTR的表達與臨床病理參數之間的關系。結果：免疫組織化學結果顯示,CFTR在上皮性卵巢癌組織中的表達比良性卵巢腫瘤組(PO.05)以及正常卵巢組(P0.05)均明顯增高,差異均有統(tǒng)計學意義,而良性卵巢腫瘤和正常卵巢組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。在上皮性卵巢癌中,CFTR蛋白的表達水平在FIGO Ⅲ/Ⅳ期組織中顯著高于Ⅰ/Ⅱ期(P0.05),病理分級2-3級組織中的表達顯著高于1級(P0.05),血漿Ca-12535 U/ml的組織中表達顯著高于Ca-12535 U/ml的組織(P0.05),但與患者年齡、腫瘤大小、血漿HE4水平無關(P0.05)。在各個病理類型中,漿液性囊腺癌中CFTR的表達水平比粘液性囊腺癌(P0.05)和子宮內膜樣癌(P0.05)高,差異具有統(tǒng)計學意義。結論：在上皮性卵巢癌組織中CFTR高表達。高水平的CFTR與上皮性卵巢癌分期、腫瘤分化、血漿Ca-125值有關,CFTR的高表達可能與臨床不良預后有關。卵巢漿液性囊腺癌組織中的CFTR表達水平比其他病理類型高,這說明CFTR可能在漿液性囊腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。第二部分CFTR基因特異性shRNA穩(wěn)定轉染上皮性卵巢癌細胞株的篩選及人CFTR基因重組腺病毒的包裝及鑒定目的：應用人CFTR基因特異性短發(fā)卡RNA (shRNA)真核質粒表達載體轉染卵巢癌細胞,通過嘌呤霉素篩選,建立穩(wěn)定轉染的卵巢癌細胞株,并檢測驗證。構建包含人CFTR基因的重組腺病毒真核表達載體,使用HEK293細胞包裝重組腺病毒。利用穩(wěn)定轉染卵巢癌細胞株和重組腺病毒,為后續(xù)研究奠定實驗基礎。方法：質粒轉化大腸桿菌法擴增CFTR基因特異性shRNA表達質粒,并酶切鑒定。將shRNA質粒通過PolyJetTM轉染到A2780、 SKOV3細胞中,對轉染后細胞進行嘌呤霉素加壓篩選,熒光顯微鏡觀察后,挑選克隆,擴大培養(yǎng),直至建立穩(wěn)定轉染細胞株。采用Western blot法分別檢測轉染組、陰性對照組及未轉染組細胞中CFTR蛋白表達量的變化,驗證和篩選CFTR基因抑制效應最顯著的穩(wěn)定轉染細胞株。將目的片段人CFTR基因經酶切、分離、純化,構建pAdTrace-CFTR-TOX質粒并酶切及測序鑒定。利用BJ5183細菌行質粒pAdTrace-CFTR的同源重組,然后酶切及PCR法鑒定。將同源重組質粒pAdTrace-CFTR線性化后轉染HEK293細胞,進行病毒的包裝和擴增。乒乓感染法制備高滴度Ad-CFTR腺病毒。Western blot檢測病毒感染后卵巢癌細胞CFTR蛋白表達水平。結果：經酶切驗證,成功擴增CFTR特異性shRNA表達質粒。將CFTR-shRNA-1, CFTR-shRNA-2, CFTR-shRNA-3, CFTR-shRNA-4和陰性對照成功轉染A278、SKOV3細胞,嘌呤霉素霉素加壓篩選獲得穩(wěn)定表達的單克隆細胞株。熒光顯微鏡觀察細胞克隆的GFP表達,成功驗證和篩選有均勻GFP熒光的細胞克隆。通過Western blot法檢測CFTR蛋白表達,驗證和篩選CFTR基因抑制效果最顯著的穩(wěn)定轉染上皮性卵巢癌細胞株A2780-CFTRi2和SKOV3-CFTRi3細胞。經酶切后瓊脂糖電泳鑒定表明目的人CFTR基因分離成功。經酶切后瓊脂糖電泳及基因測序表明重組質粒pAdTrace-CFTR-TOX構建成功。經酶切后瓊脂糖電泳、PCR法檢測表明同源重組質粒pAdTrace-CFTR構建成功。經熒光顯微鏡觀察HEK293細胞中的RFP表達,表明Ad-CFTR腺病毒包裝及擴增成功。熒光顯微鏡觀察Ad-CFTR腺病毒感染卵巢癌細胞效率,western blot分析表明腺病毒Ad-CFTR感染后細胞CFTR蛋白表達增加,說明重組腺病毒Ad-CFTR構建成功。結論：成功擴增和鑒定了CFTR基因的特異性重組質粒。利用細胞轉染和嘌呤霉素篩選成功獲得了CFTR基因抑制效果最顯著的穩(wěn)定轉染上皮性卵巢癌細胞株。成功構建重組腺病毒真核表達載體pAdTrace-CFTR-TOX,利用pAdEasy系統(tǒng)成功包裝獲得過表達人CFTR基因的腺病毒,為進一步研究CFTR惡性生物學行為及其分子機制奠定了實驗基礎。第三部分CFTR參與調節(jié)上皮性卵巢癌細胞侵襲轉移行為及機制的實驗研究目的：探討CFTR對卵巢癌A2780、SKOV3細胞侵襲、遷移、增殖和粘附等一系列惡性生物學行為的影響及其可能分子機制。方法:Transwell小室實驗檢測CFTRi細胞的遷移、侵襲能力變化。劃痕實驗檢測CFTR過表達細胞遷移能力的變化。細胞粘附實驗分析CFTRi細胞的粘附能力改變。細胞增殖實驗測定CFTRi細胞增殖能力改變。平板克隆形成實驗觀察CFTRi細胞的克隆形成能力變化。裸鼠皮下移成瘤實驗觀察CFTRi細胞體內成瘤能力變化,HE染色觀察裸鼠移植瘤組織形態(tài)學變化。重組腺病毒Ad-CFTR感染卵巢癌細胞A2780. SKOV3后,Western blot法檢測細胞src通路蛋白表達及其磷酸化形式的水平變化。結果：(1) Transwell、室遷移實驗結果表明,CFTRi細胞的遷移能力受到抑制。與對照組相比,約有63.11%的A2780-CFTRi細胞未能穿過基膜。而SKOV3-CFTRi細胞與對照組細胞相比,遷移能力減少了41.72%。(2) Transwell小室侵襲實驗結果顯示,CFTRi細胞的侵襲能力受到抑制。與對照組相比,約有63.93%的A2780-CFTRi細胞未能穿過基膜。而SKOV3-CFTRi細胞與對照組細胞相比,侵襲能力減少了60.89%。(3)細胞劃痕實驗結果表明,Ad-CFTR感染后細胞遷移能力增加。A2780-Ad-CFTR組比對照組遷移能力增加了39.5%,同樣的,SKOV3-Ad-CFTR組遷移程度比對照組增加39.3%。(4)細胞粘附實驗顯示,CFTRi細胞的粘附能力顯著降低。A2780-CFTRi細胞株粘附能力降低了約38.52%,而SKOV3-CFTRi粘附能力減少了42.31%。(5)細胞增殖實驗顯示出了CFTRi細胞增殖能力的降低。A2780-CFTRi和SKOV3-CFTRi細胞與對照組細胞相比均表現(xiàn)出增殖能力的降低。(6)平板克隆形成實驗表明,CFTRi表現(xiàn)出克隆形成能力的降低。A2780-CFTRi和SKOV3-CFTRi細胞與對照組細胞相比均表現(xiàn)出克隆形成能力的降低。(7)裸鼠皮下移成瘤實驗發(fā)現(xiàn),CFTRi細胞移植瘤瘤體生長速度緩慢,體積減小,移植瘤重量減少。HE染色發(fā)現(xiàn)CFTRi組移植瘤細胞排列相對整齊。(8)各組細胞總的c-Src和磷酸化-Src419(Tyr419)表達量的變化均沒有統(tǒng)計學意義,CFTR過表達的組細胞表現(xiàn)出了磷酸化-Src530 (Tyr530)的激活。結論：CFTRi卵巢癌細胞表現(xiàn)出了細胞的侵襲轉移能力、增殖能力、克隆形成能力和體內成瘤能力的顯著抑制,Ad-CFTR感染后細胞表現(xiàn)出了遷移能力的增加,從正反兩方面證實了CFTR在上皮性卵巢癌侵襲遷移、增殖、克隆形成等惡性生物學行為中的作用。在上皮性卵巢癌細胞中,上調的CFTR可能間接通過EBP50-Cbp-Csk影響到Tyr-527/530位點的磷酸化,從而影響侵襲、遷移等一系列惡性生物學行為。CFTR有可能是src信號轉導通路潛在的調節(jié)因子。
[Abstract]:Ovarian cancer is one of the most common malignant tumors in the female reproductive system . In the developed countries , the most common pathological type is epithelial ovarian cancer . In developed countries , epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecological tumor , and more than 70 % of them are involved in the development of ovarian cancer . The expression level of CFTR protein in ovarian serous cystadenocarcinoma was significantly higher than that in benign ovarian tumor group ( P0.05 ) . The expression of CFTR gene was successfully amplified and screened . The results showed that the expression of CFTR gene was successful . Compared with the control group , the ability of migration of CFTRi cells decreased by 39.3 % . Conclusion : CFTR may indirectly affect the invasion , proliferation and clonal formation of epithelial ovarian carcinoma . In the epithelial ovarian cancer cells , the up - regulated CFTR may indirectly affect the phosphorylation of Tyr - 527 / 530 sites by EBP50 - Cbp - Csk .
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31

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本文編號：2125607