本文選題：CUL4B + miRNA　； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征,90%以上的腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的、多因素調(diào)控的動態(tài)過程,它的發(fā)生涉及多個復(fù)雜信號通路,這些信號通路的激活及相互作用促使腫瘤從原發(fā)部位向周圍組織浸潤,經(jīng)血管、淋巴管或體腔到達(dá)遠(yuǎn)端部位繼續(xù)生長,形成與原發(fā)瘤性質(zhì)相同的腫瘤。深入探索侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路及分子機制,將有助于識別潛在的腫瘤治療靶點,尋找制約臨床治療發(fā)展的突破口。CUL4B屬于Cullin基因家族,該家族成員作為骨架蛋白是泛素E3連接酶(Cullin-RING E3 ubiquitin ligases,CRLs)的重要組成部分。CRLs 是目前已知的最人一類泛素連接酶,參與調(diào)控細(xì)胞周期、信號傳導(dǎo)、DNA損傷修復(fù)及染色質(zhì)重塑等重要生理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)CUL4B在食管癌、肺癌、直腸癌、宮頸癌和肝癌等多種腫瘤組織中高表達(dá),克隆形成實驗、裸鼠成瘤實驗等進(jìn)一步證實了 CUL4B 可能是一個新穎的癌基因。CUL4B與DDB1、ROC1及底物受體蛋白結(jié)合構(gòu)成CRL4B復(fù)合物。我們和其他研究者已有數(shù)據(jù)提示CRL4B可通過單泛素化 H2AK119,協(xié)同轉(zhuǎn)錄抑制 PRC2、SUV39H1/HP1/DNMT 以及 SIN3A/HDAC蛋白復(fù)合物。此外,CRL4B可負(fù)向調(diào)控多種抑癌基因和重要蛋白如P16、PTEN、IGFBP3、Wnt通路拮抗劑分子等,促進(jìn)實體瘤發(fā)生發(fā)展。但是CUL4B在腫瘤中的研究目前尚處于起步階段,人們對CUL4B在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中如何發(fā)揮作用仍知之甚少。胃癌具有高發(fā)生率和死亡率,是最常見的威脅人類健康的消化道惡性疾病。GEO(Gene Expression Omnibus)和 TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示CUL4BmRNA水平在胃癌組織中顯著高于正常胃粘膜組織。另一方面,我們課題組主要致力于前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)生機制的研究及預(yù)后標(biāo)志物的篩選等。在前期工作中,我們發(fā)現(xiàn)SOX4過表達(dá)是我國前列腺癌患者的獨立不良預(yù)后因子,可作為獨立指標(biāo)判定病人預(yù)后;SOX4可協(xié)同TMPRSS2-ERG融合基因促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)發(fā)生。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)CUL4B和SOX4基因在前列腺癌組織中表達(dá)密切相關(guān)。綜上,我們推測CUL4B在胃癌和前列腺癌中均可能發(fā)揮致癌基因作用。因此,我們系統(tǒng)探討CUL4B在胃癌和前列腺癌惡性進(jìn)展中的作用和調(diào)控機制。本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析,運用臨床組織樣本,體外細(xì)胞模型及體內(nèi)荷瘤裸鼠模型明確CUL4B在胃癌和前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,并深入探討其潛在的分子機制,為胃癌和前列腺癌治療提供新思路。第一部分CUL4B通過調(diào)控miR-125a及其靶基因HER2促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移研究報道,CUL4B在多種實體腫瘤中高表達(dá),并通過表觀遺傳學(xué)抑制多種抑癌基因和重要蛋白促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是目前尚無CUL4B在胃癌中的作用及分子機制的研究。因此,本部分以胃癌細(xì)胞系和胃癌組織標(biāo)本為研究對象,從臨床標(biāo)本,細(xì)胞水平及動物水平三個層面進(jìn)行功能和分子機制的研究,取得了如下結(jié)果:1.CUL4B在胃癌組織高表達(dá),并與不良預(yù)后有關(guān):我們首先運用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測CUL4B在154例胃癌組織中的表達(dá),并運用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCGA/GEO)分析CUL4B在胃癌組織及配對正常組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示,CUL4B在胃癌組織中表達(dá)明顯上調(diào),其表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)。隨后系統(tǒng)分析了CUL4B過表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)及常見基因異常的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示CUL4B過表達(dá)與HER2和EGFR表達(dá)顯著正相關(guān),并與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌浸潤深度呈顯著相關(guān)。2.CUL4B促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖及腫瘤生長:為了探討CUL4B在胃癌中的生物學(xué)作用,我們構(gòu)建了 CUL4B干擾或過表達(dá)的胃癌細(xì)胞株MKN45和BGC823。EdU、MTS及平板克隆實驗數(shù)據(jù)顯示,干擾CUL4B表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞MKN45和BGC823增殖;相反,過表達(dá)CUL4B胃癌細(xì)胞增殖活性增強。皮下裸鼠成瘤進(jìn)一步證實,穩(wěn)定干擾CUL4B表達(dá)可延緩腫瘤生長。3.CUL4B在體內(nèi)外可促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移:劃痕和Transwell小室實驗結(jié)果顯示,CUL4B可顯著促進(jìn)MKN45和BGC823細(xì)胞遷移和浸潤。皮下和尾靜脈移植瘤實驗證實,CUL4B低表達(dá)可顯著減弱MKN45細(xì)胞肌層浸潤以及肺轉(zhuǎn)移能力。眾所周知,EMT發(fā)生可使細(xì)胞獲得遷移浸潤能力,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們的數(shù)據(jù)顯示,在MKN45細(xì)胞中干擾CUL4B表達(dá)后細(xì)胞變的更圓,具有上皮形態(tài);相反,過表達(dá)CUL4B后細(xì)胞變梭形,細(xì)胞間的連接變的松散。免疫熒光、RT-qPCR及western-blot數(shù)據(jù)提示,CUL4B表達(dá)沉默可引起MKN45及BGC823細(xì)胞皮指標(biāo)(E-cadherin,Claudin-1)表達(dá)升高而間質(zhì)指標(biāo)((Vimentin,N-cadherin)表達(dá)明顯下降。4.CUL4B是miR-101的直接靶基因:根據(jù)miRNA靶基因預(yù)測軟件(TargetScan、PicTar和miRanda)預(yù)測,我們選取了 4個可能調(diào)控CUL4B的miRNAs(miR-101、miR-204、miR-217及miR-133)進(jìn)行后續(xù)驗證。MKN45細(xì)胞轉(zhuǎn)染上述4個miRNAs mimics及陰性對照NC后,western-blot結(jié)果顯示,MKN45細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-101mimics后CUL4B表達(dá)下降趨勢最明顯。雙熒光素酶活性實驗結(jié)果也表明,miR-101mimics 可顯著減弱野生型CUL4B 3'UTR載體熒光素酶活性,而miR-101inhibitor 則上調(diào)其光素酶活性。然而,miR-101mimics 和 miR-101inhibitor對突變型載體熒光素酶活性并沒有類似作用。5.在蛋白水平上,CUL4B和HER2表達(dá)正相關(guān):為系統(tǒng)探 CUL4B在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的分子機制,我們在MKN45細(xì)胞中瞬時干擾CUL4B表達(dá),并進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)955個差異表達(dá)的基因(554個基因表達(dá)下調(diào),401個基因表達(dá)上調(diào))。進(jìn)一步對表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)分析,發(fā)現(xiàn)在MKN45細(xì)胞中干擾CUL4B表達(dá)后,差異基因明顯富集在HER2、EIF4E及VEGF-A信號通路。Western-blot及免疫熒光數(shù)據(jù)均提示,CUL4B表達(dá)與HER2表達(dá)正相關(guān)。裸鼠腫瘤組織和胃癌組織樣本也進(jìn)一步證實,CUL4B和HER2之間存在一定的關(guān)系。然而,我們在mRNA水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)兩者的關(guān)聯(lián)性。因此,我們推測CUL4B可能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控HER2蛋白表達(dá)。6.CUL4B通過轉(zhuǎn)錄抑制miR-125a表達(dá)正向調(diào)控HER2表達(dá):我們對miRNA-seq數(shù)據(jù)和靶基因是HER2的miRNAs(由TargetScan和miRanda預(yù)測)進(jìn)行Venn圖分析,得到了 3個miRNAs:miR-125a、miR-1254及miR-193a。結(jié)合文獻(xiàn)報道及RT-qPCR驗證,我們選取miR-125a進(jìn)行后續(xù)研究。RT-qPCR數(shù)據(jù)表明,干擾CUL4B表達(dá)可上調(diào)Pri-miR-125a,Pre-miR-25a及miR-125a的表達(dá),而過表達(dá)CUL4B顯著減少其表達(dá)。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗證實CUL4B可通過直接結(jié)合到miR-125a啟動子區(qū)(S2位置)來抑制miR-125a的表達(dá)。此外,我們在胃癌組織樣本中發(fā)現(xiàn)miR-125a與CUL4B表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。Western-blot數(shù)據(jù)顯示胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-125a mimics,可顯著降低HER2的表達(dá),轉(zhuǎn)染miR-125a inhibitor則上調(diào)HER2表達(dá)。重要的是,熒光素酶實驗證實,胃癌細(xì)胞共轉(zhuǎn)染野生型HER2 3'UTR質(zhì)粒和miR-125a mimics,熒光素酶活性明顯減弱,而miR-125a inhibitor卻增強熒光素酶活性。7.miR-125a參與CUL4B介導(dǎo)HER2的表達(dá)及胃癌細(xì)胞遷移:western-blot結(jié)果顯示,CUL4B過表達(dá)可顯著增強HER2的表達(dá),而過表達(dá)CUL4B的同時過表達(dá)miR-125a可部分減弱HER2的表達(dá)。Rescue實驗證實,過表達(dá)miR-125a可部分阻斷CUL4B誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞侵襲。8.HER2抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)CUL4B過表達(dá)誘導(dǎo)的EMT和轉(zhuǎn)移:體外實驗數(shù)據(jù)顯示,在MKN45細(xì)胞中HER2抑制劑(赫賽汀/siHER2)可部分逆轉(zhuǎn)CUL4B過表達(dá)引起的EMT表型變化。為了進(jìn)一步證實細(xì)胞學(xué)實驗數(shù)據(jù),我們運用皮下移植瘤和尾靜脈移植瘤模型進(jìn)行體內(nèi)研究。腫瘤體積長到200mm3時,用赫賽汀(20mg/Kg)或PBS作為對照處理腫瘤異種移植物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)赫賽汀可部分阻斷CUL4B過表達(dá)引起的胃癌細(xì)胞生長及肺轉(zhuǎn)移。綜上所述,在胃癌中,CUL4B通過轉(zhuǎn)錄抑制miR-125a表達(dá)正向調(diào)控HER2表達(dá)。HER2特異性抑制劑可有效干擾CUL4B-miR-125a-HER2-PI3K/AKT軸,進(jìn)而阻斷CUL4B誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及EMT的發(fā)生。第二部分CUL4B通過調(diào)控miR-204及其靶基因SOX4促進(jìn)前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移前列腺癌是西方國家男性腫瘤相關(guān)性死亡的主要原因,約90%癌癥相關(guān)死亡歸因于腫瘤高復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率。闡明前列腺癌惡性進(jìn)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的分子機制顯得尤為重要。本研究圍繞"CUL4B-miR-204-SOX4軸"與前列腺癌惡性進(jìn)展的關(guān)系這一科學(xué)問題展開,闡明CUL4B在前列腺癌惡性進(jìn)展中的生物學(xué)作用及分子調(diào)控機制,為前列腺癌早期有效診斷、治療策略選擇及預(yù)后評估開辟新的途徑。目前取得以下研究成果:1.CUL4B在前列腺癌組織表達(dá)上調(diào),與前列腺癌惡性進(jìn)展高度相關(guān):免疫組織化學(xué)及公共數(shù)據(jù)庫(TCGA/GEO)分析結(jié)果顯示,CUL4BmRNA和蛋白水平在前列腺癌組織中表達(dá)均顯著上調(diào)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),CUL4B過表達(dá)與Gleason評分、臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈顯著相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析提示CUL4B過表達(dá)與生化復(fù)發(fā)高度相關(guān)。2.CUL4B促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖:EdU及MTS結(jié)果顯示,與對照組相比,CUL4B低表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖;反之,CUL4B過表達(dá)可增強細(xì)胞增殖活性。22RV1細(xì)胞也得到相似數(shù)據(jù)。此外,平板克降形成實驗表明,在VCaP細(xì)胞中低表達(dá)CUL4B細(xì)胞克隆集落能力減弱;而過表達(dá)CUL4B可增強細(xì)胞克隆集落形成能力。體內(nèi)動物實驗進(jìn)一步證實,干擾CUL4B表達(dá)可抑制腫瘤生長。3.CUL4B可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞EMT發(fā)生:Transwell數(shù)據(jù)顯示,CUL4B低表達(dá)顯著抑制VCaP和22RV1細(xì)胞遷移和浸潤;相反,過表達(dá)CUL4B導(dǎo)致細(xì)胞遷移和浸潤能力增強。隨后,我們探討CUL4B介導(dǎo)的細(xì)胞遷移浸潤是否是EMT誘導(dǎo)的。RT-qPCR及western-blot數(shù)據(jù)顯示,抑制CUL4B表達(dá)后E-cadherin表達(dá)水平升高,而N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平降低。免疫熒光實驗得到相似的結(jié)果。4.在前列腺癌中,SOX4是CUL4B下游靶基因:我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SOX4通過介導(dǎo)EMT在前列腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,并且和不良預(yù)后有關(guān)。此外,CUL4B在食管癌和宮頸癌等多種實體瘤中表達(dá)上調(diào),發(fā)揮致癌作用。這提示CUL4B和SOX4之間可能存在一定的關(guān)聯(lián)。與預(yù)期一致的是,western-blot結(jié)果顯示,在VCaP細(xì)胞和22RV1細(xì)胞中抑制CUL4B表達(dá)SOX4表達(dá)水平降低;相反,過表達(dá)CUL4B可引起SOX4表達(dá)水平升高。免疫熒光數(shù)據(jù)也提示CUL4B表達(dá)與SOX4表達(dá)正相關(guān)。前列腺癌患者組織樣本中CUL4B和SOX4免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示,CUL4B和SOX4在Gleason評分=8-10的病例中的表達(dá)均顯著高于Gleason評分=6-7的病例,提示CUL4B與SOX4表達(dá)呈正相關(guān)。5.CUL4B通過激活SOX4正向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路:Wnt/β-catenin信號通路與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我們的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),在VCaP及22RV1細(xì)胞中分別干擾CUL4B表達(dá)均可導(dǎo)致Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin和CyclinD1表達(dá)水平降低。在VCaP細(xì)胞中過表達(dá)CUL4B、β-catenin和CyclinD1表達(dá)水平升高。而同時過表達(dá)CUL4B并抑制SOX4表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)CUL4B過表達(dá)引起的β-catenin和CyclinD1表達(dá)上調(diào)。6.CUL4B通過轉(zhuǎn)錄抑制miR-204表達(dá)正向調(diào)控SOX4表達(dá):上述研究發(fā)現(xiàn)CUL4B在蛋白水平上正向調(diào)控SOX4,但是RT-qPCR數(shù)據(jù)顯示,SOX4mRNA水平的變化不受CUL4B影響,提示CUL4B調(diào)控SOX4的表達(dá)可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。結(jié)合miRNA靶基因預(yù)測軟件(TargetScan、miRDB、PicTar和RNA22)及RT-qPCR篩選,我們最終選取miR-204進(jìn)行后續(xù)研究。ChIP結(jié)果證實CUL4B直接結(jié)合到miR-204啟動子區(qū)。Western-blot數(shù)據(jù)顯示,VCaP及22RV1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-204 mimics可顯著降低SOX4的表達(dá)。而轉(zhuǎn)染miR-204 inhibitor可上調(diào)SOX4表達(dá)。此外,熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)VCaP及HERK293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染野生型pmiR-GLO-SOX4 3'UTR質(zhì)粒和miR-125amimics,熒光素酶活性明顯降低;而共轉(zhuǎn)染突變型pmiR-GLO-SOX4 3-UTR質(zhì)粒和miR-125a mimics,熒光素酶活性未見明顯變化。7.miR-204參與CUL4B誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞遷移浸潤:western-blot、劃痕及Transwell小室實驗顯示CUL4B過表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,并增強細(xì)胞遷移浸潤能力。同時過表達(dá)CUL4B和miR-204可以逆轉(zhuǎn)CUL4B過表達(dá)引起的上述表型變化。綜上所述,CUL4B是驅(qū)動前列腺癌轉(zhuǎn)移和進(jìn)展的關(guān)鍵癌基因。CUL4B可通過轉(zhuǎn)錄抑制miR-204正向調(diào)控SOX4的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移。miR-204可部分逆轉(zhuǎn)"CUL4B-miR-204-SOX4軸"誘導(dǎo)的前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移。上述研究我們的研究結(jié)果豐富了對侵襲性前列腺癌分子機制的認(rèn)識,為侵襲性前列腺癌的干預(yù)提供新靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2;R737.25
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本文編號：2110356