本文選題：活體光學成像 + 多色標記��； 參考：《華中科技大學》2016年博士論文

【摘要】：腫瘤免疫治療的全過程類似于一個“黑匣子”,科學家們已了解的是輸入信息“免疫治療”和輸出結(jié)果“腫瘤消退”。然而,人們對于整個治療過程中在什么時間和地點發(fā)生了哪些重要的細胞與分子事件,目前仍然所知不多�；铙w光學成像技術具有可視化、高時空分辨率、高靈敏度、實時動態(tài)和多通道檢測等優(yōu)點,在腫瘤免疫學研究領域已展現(xiàn)了其巨大的應用潛力。活體光學成像技術可以對腫瘤免疫治療過程中腫瘤微環(huán)境內(nèi)多種免疫細胞的聚集、遷移以及細胞接觸等事件進行長時程動態(tài)研究,給相關免疫學機制解析提供直觀可視化動態(tài)信息。本論文中,我們使用環(huán)磷酰胺-過繼細胞(CTX-ACT)聯(lián)合免疫治療方案,在活體腫瘤微環(huán)境內(nèi)觀察免疫細胞與黑色素瘤細胞之間的博弈過程。盡管CTX-ACT聯(lián)合免疫療法在臨床已經(jīng)取得了一定的抗腫瘤療效,但是這一治療方案是如何影響腫瘤微環(huán)境內(nèi)參與的免疫細胞,進而影響免疫治療效果,目前仍然不清楚,尤其缺乏腫瘤微環(huán)境內(nèi)多種免疫細胞的運動行為特征,以及使用這些信息表征其免疫學功能這方面的研究。因此,本論文構(gòu)建了多色標記的腫瘤微環(huán)境模型,通過大視野活體顯微成像技術對于CTX-ACT聯(lián)合免疫治療誘發(fā)的免疫反應關鍵細胞事件,在腫瘤微環(huán)境內(nèi)進行直觀可視化觀察與研究。進而,根據(jù)活體成像的結(jié)果對免疫治療方案進行改進,獲得了更加理想的腫瘤免疫治療效果。本論文主要取得了以下研究成果:(1)建立適用于活體光學成像的多色標記腫瘤微環(huán)境的荷瘤鼠模型。本論文研究工作基于多色熒光標記技術、大視野活體光學顯微成像技術以及小鼠背部皮窗模型,實現(xiàn)了對腫瘤微環(huán)境的藍色熒光蛋白(CFP)標記的黑色素腫瘤細胞,近紅外染料(Di R-BOA)標記的血管,以及綠色熒光蛋白(EGFP)、紅色熒光蛋白(m RFP)和黃色熒光蛋白(YFP)標記的多種免疫細胞的同步動態(tài)顯微成像,為活體顯微光學成像系統(tǒng)性研究腫瘤免疫治療過程中腫瘤微環(huán)境內(nèi)多種免疫細胞的時空動態(tài)變化提供了理想的活體多色標記模型。(2)顯微光學成像動態(tài)觀察特異性CTL(細胞毒性T細胞)體外殺傷腫瘤細胞的全過程。激光共聚焦時間序列成像的結(jié)果顯示,在體外培養(yǎng)的條件下,幾十個CFSE(綠色熒光染料)標記的CTL圍繞在一團CFP標記的B16細胞周圍,相互接觸30~40min后,B16細胞的形態(tài)一開始并未發(fā)生顯著性變化,但是其熒光信號逐個迅速消失,細胞形態(tài)快速瓦解,出現(xiàn)“瞬間破裂”的快速連鎖式死亡,這一成像結(jié)果提示我們,CTL在體外對腫瘤細胞的殺傷反應是快速、高效的。(3)活體光學成像研究腫瘤免疫治療過程中的免疫細胞動態(tài)參與及其與療效的相關性。實現(xiàn)了對CTX-ACT聯(lián)合免疫治療后腫瘤微環(huán)境中m RFP標記的Treg,CFSE標記的回輸CTL,YFP標記的DC以及CFP標記的B16腫瘤細胞的活體長時程動態(tài)顯微成像觀察�；铙w成像結(jié)果表明,Treg在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期聚集到腫瘤區(qū)域,并在實體腫瘤形成后,圍繞在其周圍形成一個環(huán)形的“免疫耐受圈”,導致大部分回輸?shù)腃TL無法遷移到腫瘤區(qū)域。在ACT治療前對荷瘤小鼠進行CTX治療,可以清除荷瘤鼠的大部分Treg細胞,從而無法在實體腫瘤外圍形成“免疫耐受圈”,這有利于回輸CTL和DC募集到腫瘤區(qū)域并浸潤到腫瘤實質(zhì)內(nèi)部,進而有效地誘發(fā)抗腫瘤免疫反應。(4)動態(tài)研究腫瘤免疫治療過程中多種免疫細胞的運動行為特征�；铙w成像結(jié)果表明,CTX-ACT聯(lián)合治療后,回輸?shù)腃TL在腫瘤區(qū)域的運動可以細分為四個階段。在進入第3階段(CTX-ACT治療后第5天)時,CTL可以大量募集到腫瘤區(qū)域,并且其在腫瘤邊緣和腫瘤實質(zhì)內(nèi)的運動活躍程度都迅速增加,分別達到5.79±3.12μm/min和3.22±2.58μm/min。與此同時,對腫瘤的殺傷效應達到頂峰,腫瘤出現(xiàn)大面積死亡,外部開始“萎縮”,內(nèi)部開始“瓦解”。在CTX-ACT聯(lián)合治療后24 h,內(nèi)源的TII(腫瘤浸潤性免疫細胞)被誘導活化,其平均速度迅速增至4.92±2.8μm/min,該速度是ACT治療前的2.4倍,是聯(lián)合治療后48 h的3.26倍。與此同時,大部分TII的運動是朝向腫瘤實質(zhì)內(nèi)快速遷移,從而進一步激活后續(xù)的抗腫瘤免疫反應�；铙w顯微成像對多種免疫細胞(DC、CTL以及TII)的運動行為進行觀察發(fā)現(xiàn),免疫細胞的活體運動具有“走走停停相互交替”以及“折線形運動”這兩個顯著特征,利用本實驗室建立的“折線形廣義利維運動”模型能夠精確地描繪免疫細胞這兩個活體運動特征。綜上所述,本論文建立了多色標記的腫瘤微環(huán)境荷瘤鼠模型,通過活體顯微成像技術,成功獲取了腫瘤免疫治療過程中腫瘤微環(huán)境多種免疫細胞的聚集、空間分布、遷移以及相互接觸等動態(tài)信息,從而動態(tài)展示了CTX-ACT聯(lián)合治療抑制腫瘤生長的過程:聯(lián)合治療阻止Treg在實體腫瘤外周形成“免疫耐受圈”,誘發(fā)內(nèi)源性TII短暫活化并朝向腫瘤區(qū)域快速遷移,進而促進回輸CTL和DC募集到腫瘤區(qū)域并浸潤到實質(zhì)內(nèi)�；铙w動態(tài)成像結(jié)果表明,外源的CTX與ACT聯(lián)合治療過程誘導內(nèi)源性免疫活化,所產(chǎn)生的“協(xié)同免疫增強”效應是獲得理想腫瘤免疫治療效果的關鍵因素。
[Abstract]:The whole process of tumor immunotherapy is similar to a "black box", which scientists have known is the input information "immunotherapy" and the output "tumor regression". However, what important cell and molecular events have occurred at what time and location throughout the treatment are still unknown. Imaging technology has the advantages of visualization, high temporal spatial resolution, high sensitivity, real-time dynamic and multi-channel detection. It has shown great potential application in the field of cancer immunology. The living optical imaging technology can accumulate, migrate, and contact a variety of immune cells in tumor Microrings during the tumor immunotherapy. In this paper, we use a combined immunotherapy of cyclophosphamide adoptive cells (CTX-ACT) to observe the game between immune cells and melanoma cells in a living tumor microloop, although CTX-ACT combined immunization. The treatment has achieved a certain antitumor effect in clinical, but how this treatment affects immune cells involved in the tumor microring, and then affects the effect of immunotherapy, is still unclear, especially the lack of the movement of multiple immune cells in the tumor microring, and the use of these information to characterize its immunology. Therefore, the tumor microenvironment model of polychromatic markers is constructed in this paper. Through the large field of vision microimaging technique, the key cell events induced by CTX-ACT combined immunotherapy are visualized and studied in the tumor microloop, and then the immune system is immune to the results of living body imaging. The treatment scheme has been improved to achieve better effect on tumor immunotherapy. The main achievements of this thesis are as follows: (1) the establishment of a tumor bearing mouse model suitable for the multicolor microenvironment of vivo optical imaging. The mouse back skin window model realized the synchronous dynamic microimaging of many immune cells marked by blue fluorescent protein (CFP) labeled with the tumor microenvironment, the blood vessels labeled by the near infrared dye (Di R-BOA), and the green fluorescent protein (EGFP), the red fluorescent protein (m RFP) and the yellow fluorescent protein (YFP). Microscopical imaging systematically studies the spatiotemporal dynamic changes of multiple immune cells in tumor Microrings during tumor immunotherapy. (2) microscopic optical imaging dynamic observation of the whole process of specific CTL (cytotoxic T cells) killing tumor cells in vitro. Laser confocal time sequence imaging The results showed that, under the conditions of in vitro culture, dozens of CFSE (green fluorescent dye) labeled CTL around a group of CFP labeled B16 cells, after contact with 30~40min, the morphology of B16 cells did not change significantly at the beginning, but the fluorescence signal quickly disappeared, the cell morphology rapidly disintegrated and appeared "instantaneous rupture". Rapid linkage death, this imaging result suggests that the killing response of CTL to tumor cells in vitro is rapid and efficient. (3) living body optical imaging studies the dynamic participation of immune cells in the process of tumor immunotherapy and the correlation with the curative effect. The Tre marker of M RFP in the tumor microenvironment after CTX-ACT combined immunotherapy has been realized. G, CFSE labeled CTL, YFP labeled DC, and CFP labeled B16 tumor cells in vivo long term dynamic microimaging. The living imaging results showed that Treg was gathered into the tumor area early in the tumor development, and formed a circular "immune tolerance circle" around it, leading to large part of the tumor after the formation of solid tumors. CTL can not be migrated to the tumor area. Before ACT treatment, CTX treatment of tumor bearing mice can remove most of the Treg cells of the tumor bearing mice, which can not form the "immune tolerance circle" on the periphery of the solid tumor, which is beneficial to the return of CTL and DC to collect the tumor area and soak into the tumor essence, and then effectively induce the anti swelling. The tumor immune response. (4) dynamic study of the movement behavior of various immune cells in the process of tumor immunotherapy. In vivo imaging results showed that after CTX-ACT combined treatment, the movement of the returned CTL in the tumor area could be subdivided into four stages. In the third stage (fifth days after CTX-ACT treatment), the tumor area could be raised in a large amount. At the same time, the activity activity in the tumor edge and tumor substance increased rapidly, reaching 5.79 + 3.12 m/min and 3.22 + 2.58 mu m/min. respectively, at the same time, the tumor killing effect reached the peak, the tumor occurred large area death, the outside began to "atrophy", and the internal "disintegration". After the combined treatment of CTX-ACT, 24 h, endogenous TII ( The tumor infiltrating immune cells were induced to be activated, and the average speed increased rapidly to 4.92 + 2.8 m/min, 2.4 times as much as before ACT treatment and 3.26 times that of 48 h after combined treatment. At the same time, most of the TII movement was moved towards the tumor substance rapidly, thus further activating the subsequent anti-tumor immune response. The exercise behavior of multiple immune cells (DC, CTL and TII) was observed. The activity of the living body of the immune cells was characterized by the two distinct characteristics of "walking and stopping each other" and "folded line movement". The model of "folded line generalized Levi movement" established in our laboratory could accurately describe the two living bodies of immune cells. In summary, a tumor microenvironment tumor mouse model with multicolor markers was established in this paper. Through the microimaging technique of living body, the dynamic information on the aggregation, spatial distribution, migration and contact of various immune cells in the tumor microenvironment was successfully obtained by living microscopic imaging technique, which dynamically demonstrated the combined treatment of CTX-ACT. The process of tumor growth: combined therapy prevents Treg from forming a "immune tolerance circle" in the periphery of the solid tumor, inducing transient activation of endogenous TII and moving rapidly towards the tumor area, and then promoting the retransmission of CTL and DC to collect the tumor area and infiltrate into the substance. The synergistic immune enhancement effect induced by endogenous immune activation is the key factor to achieve the desired effect of tumor immunotherapy.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.51

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本文編號：2107585