本文選題：乳腺癌 + 著絲粒蛋白��； 參考：《天津醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：背景:著絲粒蛋白-U(centromere protein U,CENP-U),作為重要的常駐性著絲粒結合蛋白之一,是動粒內層組成CCAN網絡(constitutively centromere-associated network,CCAN)的重要原件之一,參與中期成熟動粒的組裝,在細胞有絲分裂的過程中發(fā)揮了重要的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)CENP-U表達情況與惡性腫瘤密切相關。本課題組擬通過體內、體外實驗及臨床病例資料研究闡明CENP-U在乳腺癌細胞增殖及轉移中的作用和機制,豐富現(xiàn)有CENP-U基因功能的認識,為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的研究提供新的靶點。方法:1.利用免疫組化的方法分別檢測乳腺導管內癌、乳腺癌及其配對癌旁組織中CENP-U蛋白的差異表達情況,同時比較轉移組和未轉移組患者間CENP-U不同表達情況;并進行CENP-U與浸潤性導管癌患者預后的相關性分析。2.利用Western-blotting實驗和免疫熒光實驗檢測正常乳腺上皮細胞及人乳腺癌細胞系中CENP-U蛋白的表達情況。3.構建沉默/過表達CENP-U穩(wěn)轉細胞系,繪制細胞的生長曲線,采用平板克隆、軟瓊脂克隆、免疫熒光等實驗,觀察沉默/過表達CENP-U表達對乳腺癌細胞和正常乳腺細胞的生物學行為的影響。4.利用流式細胞術,檢測沉默/過表達CENP-U表達對細胞周期的影響,并檢測凋亡細胞的比例;并利用Western-blotting實驗檢測其PI3K/AKT/NF-κB通路蛋白活性,以了解CENP-U對乳腺癌增殖能力的調節(jié)機制。5.構建沉默/過表達CENP-U細胞的體內移植瘤模型,檢測改變CENP-U表達后對乳腺癌體內的生物學行為的影響。6.采用細胞劃痕實驗、Transwell實驗,檢測沉默/過表達CENP-U表達對乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力的影響;利用Western-blotting實驗檢測沉默/過表達CENP-U表達對EMT標志物表達的影響。7.利用Western-blotting實驗檢測乳腺癌非干細胞及干細胞中CENP-U的表達情況;利用流式細胞術檢測CENP-U沉默/過表達細胞中ALDHhigh的比例。結果:1.通過對30例導管內癌及100例浸潤性導管癌患者的組織進行CENP-U蛋白的免疫組化檢測,發(fā)現(xiàn):相較于癌旁組織,CENP-U蛋白在乳腺癌處于過表達的狀態(tài);轉移組患者的CENP-U蛋白的陽性率也顯著高于未轉移組。在生存分析中發(fā)現(xiàn):CENP-U蛋白表達陰性的浸潤性導管癌患者的DFS和OS均顯著優(yōu)于CENP-U陽性的患者。2.細胞系中MCF-10A中CENP-U蛋白表達最低,MDA-MB-231表達最高,且在耐藥細胞系中其蛋白表達量顯著增加。3.沉默CENP-U對乳腺癌增殖能力的影響:繪制細胞的生長曲線發(fā)現(xiàn),相較于sh-Control細胞,sh CENP-U細胞的生長能力受到了顯著的抑制;且sh CENP-U的克隆形成能力顯著下降。流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)sh CENP-U細胞發(fā)生凋亡的比例和處于G2/M期的比例均顯著增加;sh-CENP-U細胞的PI3K-p110α亞基、S6、NF-κB p65亞基的表達均下調,且AKT Ser473及S6 Ser235/236位點的磷酸化蛋白也顯著下降。4.過表達CENP-U對乳腺癌及正常乳腺上皮細胞增殖能力的影響:無論是在T47D還是MCF-10A,p CDH-CENP-U細胞增殖和克隆形成能力均強于p CDH-Control細胞;且p CDH-CENP-U細胞中G2/M期比例顯著增加,且PI3K-p110α亞基、NF-κB p65亞基的表達均上調,且AKT Ser473及S6Ser235/236位點的磷酸化蛋白顯著上調。5.構建裸鼠移植瘤模型,對體內移植瘤體積進行檢測發(fā)現(xiàn):MDA-MB-231-sh CENP-U細胞的體內移植瘤顯著小于對照組;而T47D-CENP-U細胞的移植瘤增長迅速。6.劃痕和Transwell實驗顯示,相較于231-sh Control細胞,231-sh CENP-U細胞的遷移和侵襲能力下降,E-cadherin和β-catenin表達上調,Vimentin和N-cadherin表達下調;而T47D-CENP-U的遷移侵襲能力較其對照組顯著增強,間質標志物表達上調,上皮標志物表達下調。7.相較于其對應的非干細胞群,乳腺癌干細胞中CENP-U表達均顯著下降。利用干細胞分子標志物ALDH,檢測了CENP-U過表達或沉默細胞系中乳腺癌ALDHhigh的比例,發(fā)現(xiàn)ALDHhigh細胞比例不受CENP-U表達情況影響。結論:1.臨床數(shù)據(jù)顯示:CENP-U蛋白表達與乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關,且CENP-U蛋白表達有可能作為預測乳腺癌患者的預后指標。2.CENP-U在乳腺癌中可能發(fā)揮著促癌基因的作用,影響乳腺癌體內、體外的生長增殖能力。CENP-U可調控細胞周期、抑制凋亡、改變乳腺癌的PI3K/AKT/NF-κB信號通路活性,以調控乳腺癌細胞的生長增殖。3.過表達CENP-U表達通過誘導乳腺癌細胞EMT表型促進其遷移和侵襲能力;沉默CENP-U表達通過抑制EMT從而影響乳腺癌細胞遷移和侵襲。4.乳腺癌干細胞中CENP-U蛋白表達較低,CENP-U表達水平的改變對乳腺癌干細胞無影響。
[Abstract]:The expression of CENP - U protein in breast cancer cells and human breast cancer cells was investigated by Western - blotting . The results showed that the proliferation and invasion ability of CENP - U cells were significantly higher than those in control group .
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【共引文獻】

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本文編號：2107489