本文選題：骨肉瘤 + 長(zhǎng)鏈非編碼RNA��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的分別檢測(cè)骨肉瘤組織與臨近非腫瘤組織,骨肉瘤患者血清和健康體檢人群血清長(zhǎng)鏈非編碼RNA MALATl的表達(dá)水平,并對(duì)其表達(dá)水平和骨肉瘤患者的臨床特征之間的關(guān)系,在診斷,預(yù)后中的中的價(jià)值進(jìn)行分析。在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步檢測(cè)了MALAT1在骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平,并分析MALAT1在骨肉瘤細(xì)胞增殖,凋亡和遷移,侵襲中的作用及對(duì)鈣黏蛋白和miR-205的調(diào)控,從而揭示MALAT1在骨肉瘤疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。方法1.共收集66例骨肉瘤組織及臨近非腫瘤骨組織,45例骨肉瘤患者血清及30例正常體檢人群的血清樣本。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測(cè)MALAT1及其他相關(guān)分子的表達(dá)水平。2.通過(guò)繪制ROC曲線及術(shù)后跟蹤調(diào)查來(lái)對(duì)MALAT1在骨肉瘤患者中的診斷和預(yù)后價(jià)值進(jìn)行分析。3.共使用U20S, MG63, SAOS-2和SOSP-9607四種骨肉瘤細(xì)胞系,和一種正常成骨細(xì)胞系hFOB作為對(duì)照。運(yùn)RT-qPCR方法檢測(cè)上述細(xì)胞MALAT1及其他相關(guān)分子的表達(dá)水平。4.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法對(duì)上述細(xì)胞系進(jìn)行MALAT1及其他相關(guān)分子高表達(dá)和沉默處理,處理之后進(jìn)行后續(xù)的功能試驗(yàn)或RNA和蛋白水平檢測(cè)。5.通過(guò)CCK8方法對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系的增殖能力進(jìn)行評(píng)估,通過(guò)流式凋亡細(xì)胞術(shù)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系的凋亡情況進(jìn)行評(píng)估,通過(guò)運(yùn)用transwell小室實(shí)驗(yàn)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系的遷移侵襲能力進(jìn)行檢測(cè)；運(yùn)用RNA免疫共沉淀(RIP)和DNA免疫共沉淀(CMP)方法對(duì)MALAT1與EZH2, EZH2與鈣黏蛋白之間的交聯(lián)進(jìn)行分析；運(yùn)用western blot方法或免疫熒光方法對(duì)本研究中的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果1.四種骨肉瘤細(xì)胞系U20S, MG63, SAOS-2和SOSP-9607的MALAT1表達(dá)水平顯著高于正常成骨細(xì)胞系hFOB的表達(dá)水平；66例骨肉瘤患者腫瘤組織的MALAT1表達(dá)水平顯著高于相鄰正常骨組織表達(dá)水平,而且58.8%的患者的MALAT1表達(dá)水平高于相鄰正常骨組織的表達(dá)的兩倍水平。臨床特征分析發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織的MALAT1表達(dá)水平與患者腫瘤侵襲(T),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)顯著相關(guān)。三期和四期的骨肉瘤患者的表達(dá)水平顯著高于一期和二期患者。高表達(dá)MALAT1的臨床骨肉瘤患者其總體生存時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間顯著短于低表達(dá)的患者。2. RT-qPCR發(fā)現(xiàn)MALAT1和E-cadherin的mRNA表達(dá)水平在骨肉瘤組織中呈顯著負(fù)相關(guān)。Transwelll小室實(shí)驗(yàn)提示MALAT1能夠顯著提高骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力,并且能夠顯著降低E-cadherin蛋白的表達(dá)水平并促進(jìn)Vimentin蛋白的表達(dá)。CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MALAT1能夠顯著提高骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力。3. RT-qPCR結(jié)果證明EZH2 mRNA表達(dá)水平在骨肉瘤組織中顯著升高,在骨肉瘤細(xì)胞系中也顯著升高,并且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MALAT1和EZH2表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EZH2中MALAT1富集顯著,進(jìn)一步分段RT-qPCR發(fā)現(xiàn)MALAT1的3’端與EZH2相交聯(lián)。4.EZH2能夠負(fù)向調(diào)控E-cadhein的表達(dá),并且染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)證實(shí)E-cadherin與EZH2相交聯(lián),從而抑制E-cadherin的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MALAT1下調(diào)能夠顯著降低E-cadherin與EZH2的交聯(lián)作用,從而說(shuō)明MALAT1通過(guò)與EZH2相結(jié)合作用的方式抑制E-cadherin的表達(dá)。并且功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)si-EZH2沉默EZH2之后能夠顯著逆轉(zhuǎn)MALAT1對(duì)細(xì)胞遷移侵襲能力及EMT能力的影響。5.通過(guò)miRcode生物信息學(xué)分析,我們證明了MALAT1與miR-205有結(jié)合區(qū)域,而且MALAT1和miR-205能夠相互抑制對(duì)方的表達(dá)水平,而且功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-205能夠顯著抑制MALAT1引起的細(xì)胞增殖能力的提高。從而揭示了MALAT1對(duì)細(xì)胞增殖能力影響是通過(guò)miR-205起作用。結(jié)論MALAT1在骨肉瘤組織中高表達(dá)并且腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),高表達(dá)MALAT1的患者其生存能力顯著降低,說(shuō)明MALAT1可作為骨肉瘤患者臨床預(yù)后的重要因子。相關(guān)功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MALAT1能夠顯著提高骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力,并能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖,這是通過(guò)與EZH2相關(guān)聯(lián)從而進(jìn)一步降低E-cadherin的表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。最后,我們還發(fā)現(xiàn)MALAT1與miR-205相互抑制,miR-205能夠顯著逆轉(zhuǎn)MALAT1所導(dǎo)致的升高的增殖能力�？傊�,我們揭示了MALAT1作為一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA在骨肉瘤中的預(yù)后價(jià)值和潛在功能作用機(jī)制,為臨床提高骨肉瘤患者的治療和預(yù)后具有重要的價(jià)值,通過(guò)抑制MALAT1的表達(dá)可作為臨床骨肉瘤患者的治療和提高患者預(yù)后的有效方案。
[Abstract]:Objective To investigate the expression level of MALAT1 in osteosarcoma cell line by means of real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( RT - qPCR ) .
The cross - linking between MALAT and EZH2 , EZH2 and cadherin was analyzed by means of RNA immune coprecipitation ( RIP ) and DNA immunization co - precipitation ( CMP ) method .
The expression level of MALAT was significantly higher than that of normal osteoblast - line hFOB by western blot or immunofluorescence assay . Results 1 . The expression level of MALAT1 in four osteosarcoma cell lines U20, MG63 , SAOS - 2 and SOSP - 9607 was significantly higher than that of normal osteoblast - line hFOB .
The malAT1 expression level of 66 patients with osteosarcoma was significantly higher than that of adjacent normal bone tissues , and 58.8 % of patients with osteosarcoma were significantly higher than those of adjacent normal bone tissues . The clinical feature analysis found that the level of MALAT expression in osteosarcoma was significantly correlated with the invasion of tumor ( T ) , lymph node metastasis ( N ) and distant metastasis ( M ) . The expression level of MALAT and E - cadherin was negatively correlated with the expression of malAT1 and E - cadherin in osteosarcoma . Conclusion MALAT2 can significantly reduce the expression of MALAT and EZH2 . Conclusion MALAT1 can significantly reduce the expression level of MALAT and EZH2 , and it is shown that MALAT can significantly reduce the expression level of MALAT and EZH2 .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R738.1

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本文編號(hào)：2097356