溫?zé)峄熗ㄟ^ROS誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡的實驗研究
發(fā)布時間：2018-07-04 10:25
本文選題：胃癌 + 溫?zé)峄?/strong> ； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文
【摘要】：胃癌居我國惡性腫瘤發(fā)病率的第2位、死亡率的第3位,預(yù)后很差。由于其自身的發(fā)展規(guī)律和特點,幾乎全部的胃癌患者在確診時已經(jīng)發(fā)生腹膜種植轉(zhuǎn)移或術(shù)后很快出現(xiàn)腹膜種植轉(zhuǎn)移形成腹膜癌。有針對性的預(yù)防與治療胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移對提高胃癌患者的生存質(zhì)量、改善患者的預(yù)后具有重要意義。近年來研究表明：腹腔熱灌注化療對預(yù)防與治療胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移具有較好的療效,但其確切的機理尚缺乏深入的研究。由于腫瘤細(xì)胞的耐熱性遠不如正常細(xì)胞,因此熱灌注化療可以通過高溫和增強腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性更有效的清除腫瘤細(xì)胞,其中自噬在熱灌注誘導(dǎo)腫瘤凋亡中有重要作用。研究表明,在不同的條件下,自噬既可能促進腫瘤細(xì)胞的死亡,也可能促進腫瘤細(xì)胞的存活。當(dāng)受到理化因素傷害時,如耐受放射治療,化療打擊等,腫瘤細(xì)胞可以通過提高基礎(chǔ)自噬水平,耐受更強的外界損傷因素,修復(fù)腫瘤細(xì)胞的損傷；但是,如果誘導(dǎo)細(xì)胞過度自噬,則能夠促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡,從而達到治療腫瘤的目的。目前,在臨床上經(jīng)典的自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin)已經(jīng)嘗試用于多種腫瘤的治療,并取得一定的療效。因此,近年來認(rèn)為誘導(dǎo)腫瘤自噬性死亡可能是腫瘤治療的重要策略之一。研究表明活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)能夠誘導(dǎo)自噬分子Beclin1與Bcl-2解離,從而激活Beclin 1誘導(dǎo)自噬通路,使mTOR受到抑制,使得自噬標(biāo)志物L(fēng)C3 Ⅱ表達量升高,進而啟動細(xì)胞自噬相關(guān)的信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡。最新研究發(fā)現(xiàn)：溫?zé)峄熌軌虼龠M腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平；溫?zé)峄熍浜涎趸瘧?yīng)激誘導(dǎo)劑t-BOOH,能增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平,提高對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。溫?zé)峄煷碳つ[瘤細(xì)胞高表達ROS,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,可能是溫?zé)峄熆鼓[瘤的重要機制之一綜上所述,本課題提出以下假設(shè)：溫?zé)峄熆赡芡ㄟ^促進腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡,可能是溫?zé)峄熆鼓[瘤的重要機制之一。為驗證該假設(shè),項目在細(xì)胞學(xué)實驗及動物模型兩個層面進行研究,首先模擬溫?zé)峄煑l件,研究產(chǎn)生ROS產(chǎn)生與胃癌細(xì)胞自噬基因表達的相關(guān)性,然后探討溫?zé)峄煷碳の赴┘?xì)胞產(chǎn)生ROS在自噬性死亡中的作用；進一步探討ROS誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡在溫?zé)峄煔赴┘?xì)胞中的作用。課題的完成將為腹腔熱灌注化療對預(yù)防與治療胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移的機制提供新的思路。研究目的1.研究溫?zé)峄煷碳の赴┘?xì)胞產(chǎn)生ROS與胃癌細(xì)胞自噬基因表達的相關(guān)性；2.探討溫?zé)峄煷碳の赴┘?xì)胞產(chǎn)生ROS在誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡中的作用；3.探討ROS誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡在溫?zé)峄煔赴┘?xì)胞中的作用。材料和方法一、細(xì)胞實驗水平檢測1.1奧沙利鉑藥物濃度篩選：人胃癌細(xì)胞SGC-7901進入指數(shù)生長期后,用不同濃度的奧沙利鉑(L-OHP) (10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160 μg/ml和320μg/ml)處理SGC-7901細(xì)胞,24 h后通過MTS法測定各組細(xì)胞活力,以IC50為標(biāo)準(zhǔn)確定奧沙利鉑的工作濃度。1.2熱療溫度篩選：確定奧沙利鉑工作濃度之后,用工作濃度的奧沙利鉑處理SGC-7901細(xì)胞1小時后,分別將細(xì)胞置于39℃、41℃、42℃、43℃、45℃的恒溫水浴鍋中處理1小時,再接著培養(yǎng)24小時,通過MTS法檢測細(xì)胞活力,根據(jù)實際情況確定對細(xì)胞具有較強殺傷效果的溫度。1.3細(xì)胞分組處理：待奧沙利鉑工作濃度與熱療溫度確定后,將SGC-7901細(xì)胞分為四組：(1)空白對照組(2)熱療組(3)化療組(奧沙利鉑)(4)溫?zé)峄熃M。其中空白對照組予37℃處理,不給予化療藥物奧沙利鉑處理；化療組給予工作濃度的奧沙利鉑藥物處理;熱療組給予1.2中確定的熱療溫度的溫?zé)崽幚�；溫�(zé)峄熃M給予奧沙利鉑藥物處理同時給予1.2中確定的溫度熱療。各組細(xì)胞處理1h后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行以下檢測：1.3.1流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞ROS的產(chǎn)生量；1.3.2流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位；1.3.3通過MTS法檢測各組細(xì)胞活力；1.3.4流式雙染檢測各組細(xì)胞的凋亡情況；1.3.5通過western blot檢測自噬相關(guān)基因Beclin 1、LC3B和mTOR的蛋白表達情況；1.3.6通過光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化,透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬體形成。二、動物實驗水平檢測2.1選取實驗動物SPF級BALB/C-NU(4-6周齡,體質(zhì)量18～22 g)裸鼠,在裸鼠腹股溝區(qū)一側(cè)皮下建立SGC-7901細(xì)胞裸鼠移植瘤模型。將12只裸鼠模型隨機分為4組(n=3),分別為：①control組；②熱療組(43℃,腹腔注射與L-OHP等量的葡萄糖)③常溫化療組(6mg/kg L-OHP腹腔注射給藥)④溫?zé)峄熃M(6mg/kg L-OHP腹腔注射給藥后1h,將需要熱療的實驗鼠長有腫瘤的腹股溝區(qū)浸入事先裝有已經(jīng)預(yù)熱到需要溫度的溫水小鼠盒,水的深度保持在小鼠直立時能保證腫瘤能浸在水中,將小鼠盒放入設(shè)定好同樣溫度的生化培養(yǎng)溫箱中,溫?zé)崽幚?.5 h,保證腫瘤內(nèi)部的細(xì)胞也能受熱1小時)。2.2各組實驗處理24 h后斷椎處死,取手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織,一部分制成細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀檢測各個樣品的ROS產(chǎn)生量;一部分組織做免疫組化檢測自噬相關(guān)基因Beclin 1、LC3和mTOR蛋白的含量;TUNEL檢測腫瘤組織的細(xì)胞凋亡情況。2.3實驗結(jié)果以采用origin6.0和SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析,連續(xù)型數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較用單因素方差分析,多重比較采用LSD方法；析因設(shè)計資料采用析因方差分析,以P0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果一、L-OHP藥物化療與熱療對細(xì)胞的抑制具有協(xié)同作用1.1 L-OHP對人胃癌細(xì)胞SGC-7901的活力的抑制作用與濃度呈正相關(guān)MTS法檢測細(xì)胞活力的結(jié)果顯示：不同濃度的L-OHP對SGC-7901細(xì)胞的活力均具有抑制作用,并且隨著L-OHP藥物濃度的增加,對細(xì)胞活力的抑制作用也隨之增加。統(tǒng)計結(jié)果表明八組細(xì)胞活力有統(tǒng)計學(xué)差異(F=1598.325,P=0.000),不同濃度細(xì)胞的活力兩兩比較均不同(P0.05)。根據(jù)MTS檢測細(xì)胞活力的結(jié)果,計算出細(xì)胞在不同濃度L-OHP藥物處理下的增值率和抑制率,得到L-OHP藥物的IC50為80.66μg/ml,因此采用L-OHP的工作濃度為80 μg/ml進行后續(xù)實驗。1.2熱療對細(xì)胞活力有抑制作用,并隨著熱療溫度的升高一直作用增強為了研究熱療對SGC-7901細(xì)胞活力的作用效果,我們用不同的溫度處理不加藥物的SGC-7901細(xì)胞,設(shè)定的溫度梯度為37℃、39℃、41℃、42℃、43℃、45℃,并同時用根據(jù)1.1.1中選出的L-OHP藥物濃度80 μg/ml在不同的溫度下處理細(xì)胞1 h,然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h,通過MTS法檢測各組細(xì)胞的活力。結(jié)果表明SGC-7901細(xì)胞的活力隨著溫度的增加而下降,說明溫?zé)釋?xì)胞具有殺傷作用。并且統(tǒng)計結(jié)果表明細(xì)胞受奧沙利鉑和溫度抑制作用的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=78.00,P=0.000),奧沙利鉑和溫度的主效應(yīng)也均有統(tǒng)計學(xué)差異(F=25201.956,P=0.000；F=993.630,P=0.000),同時我們通過金正均法分析藥物化療與溫?zé)嶙饔脤?xì)胞的抑制是否具有協(xié)同作用,結(jié)果顯示：當(dāng)溫度達到41度后,化療與熱療開始具有協(xié)同作用,由于臨床應(yīng)用時必須考慮病人對溫度的耐受性,根據(jù)實際情況確定熱療溫度為43℃。1.3 L-OHP藥物化療與熱療協(xié)同抑制細(xì)胞增殖根據(jù)前面的檢測分析的結(jié)果,我們選取了L-OHP藥物濃度80μg/ml和熱療溫度43℃,按前面的細(xì)胞分組方法處理各組細(xì)胞,MTS檢測結(jié)果顯示,熱療組、化療組和溫?zé)峄熃M的細(xì)胞活力與control組相比,細(xì)胞活力均有明顯下降(p0.05),其中以溫?zé)峄熃M細(xì)胞活力降低最為顯著(p0.01)。統(tǒng)計結(jié)果表明細(xì)胞受奧沙利鉑和溫度抑制作用的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=80.948,P=0.000),奧沙利鉑和溫度的主效應(yīng)也均有統(tǒng)計學(xué)差異(F=5827.421,P=0.000；F=968.003,P=0.000),同時用金正均法計算奧沙利鉑與加熱的聯(lián)合作用的效果,得出增效q值為1.370,說明L-OHP藥物化療與熱療對細(xì)胞活性的抑制具有協(xié)同作用。另外,通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)發(fā)現(xiàn),與control組相比,熱療組和常溫化療組細(xì)胞密度明顯降低,且細(xì)胞趨向變圓,其中溫?zé)峄熃M細(xì)胞生長最慢,大量細(xì)胞變圓且漂浮在培養(yǎng)液中,死亡的細(xì)胞數(shù)最多。二、L-OHP藥物化療與溫?zé)峄煂?xì)胞的殺傷作用與細(xì)胞內(nèi)過量的ROS產(chǎn)生和細(xì)胞的自噬相關(guān)2.1 L-OHP藥物化療與溫?zé)峄煷龠M細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平得到,與control組細(xì)胞相比,單獨的熱療處理或者化療處理細(xì)胞,以及同時溫?zé)峄熖幚矶寄芤鸺?xì)胞內(nèi)ROS的表達量上升(p0.05),并且結(jié)果表明同時對細(xì)胞進行溫?zé)崽幚?促進細(xì)胞內(nèi)ROS增加的效應(yīng)最為明顯(p0.01)。統(tǒng)計結(jié)果表明細(xì)胞受奧沙利鉑和溫度抑制作用的交互效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.006,P=0.118),奧沙利鉑和溫度的主效應(yīng)也均有統(tǒng)計學(xué)差異(F=1837.156,P=0.000;F=42.392,P=0.000),與前期工作中MTS檢測細(xì)胞活力的結(jié)果一致。2.2 L-OHP藥物化療和溫?zé)峄熌苁辜?xì)胞線粒體膜電位降低流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位的變化,結(jié)果顯示：與control組相比,對細(xì)胞進行單獨的熱療或者化療,以及同時對細(xì)胞熱療和化療處理都能引起細(xì)胞線粒體膜電位的下降,其中化療和熱療聯(lián)合處理組細(xì)胞的線粒體膜電位下降程度達到最高水平(p0.01),統(tǒng)計結(jié)果表明細(xì)胞受奧沙利鉑和溫度抑制作用的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=70.039,P=0.000),奧沙利鉑和溫度的主效應(yīng)也均有統(tǒng)計學(xué)差異(F=1248.867,P=0.000；F=774.044,P=0.000)。2.3 L-OHP藥物化療和熱療處理細(xì)胞能促進細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示：單獨的熱療對細(xì)胞凋亡促進效果不明顯,只是降低了細(xì)胞活性,說明單獨的熱療對細(xì)胞的殺傷作用相對較弱,而L-OHP藥物處理組的細(xì)胞和溫?zé)峄熖幚斫M的細(xì)胞都發(fā)生了細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著的增加(p0.01),還是以溫?zé)峄煂?xì)胞的殺傷作用為最強,統(tǒng)計結(jié)果表明細(xì)胞受奧沙利鉑和溫度抑制作用的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義(F=388.733,P=0.000),奧沙利鉑和溫度的主效應(yīng)也均有統(tǒng)計學(xué)差異(F=13553.926,P=0.000；F=402.304,P=0.000)。2.4 L-OHP藥物化療與熱療可以引發(fā)細(xì)胞的自噬性死亡為了進一步研究熱療和化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否與自噬相關(guān),我們通過透射電鏡分別觀察各組細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成,結(jié)果顯示：化療組和溫?zé)峄熃M細(xì)胞內(nèi)都出現(xiàn)染色質(zhì)固縮和自噬小體增加的現(xiàn)象,并且溫?zé)峄熃M細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡狀結(jié)構(gòu)和自噬小體,說明L-OHP藥物化療與熱療對SGC-7901細(xì)胞的殺傷作用與自噬相關(guān)。2.5溫?zé)峄熌軌虼龠M自噬相關(guān)基因的表達Western blot檢測各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1、mTOR的變化,結(jié)果顯示：化療組和溫?zé)峄熃M的自噬相關(guān)的LC3B、Beclin1蛋白表達有了顯著的上升,而雷帕霉素靶蛋白mTOR的表達量與自噬程度呈負(fù)相關(guān),表明化療組和溫?zé)峄熃M的細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3由Ⅰ型轉(zhuǎn)化為Ⅱ型的活性形式,Beclinl的表達量也有顯著上升,而雷帕霉素靶蛋白mTOR在自噬發(fā)生的細(xì)胞中表達量下降,進一步證明溫?zé)峄熞l(fā)的細(xì)胞死亡與自噬相關(guān),統(tǒng)計結(jié)果表明細(xì)胞受奧沙利鉑和溫度抑制作用的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義,奧沙利鉑和溫度的主效應(yīng)也均有統(tǒng)計學(xué)差異。三、動物腫瘤模型證明溫?zé)峄熌軌蛞l(fā)腫瘤細(xì)胞的自噬性死亡3.1胃癌實驗動物模型方法的建立結(jié)果表明,將5×106個活細(xì)胞皮下注射接種到裸鼠腹股溝區(qū)皮下,可以建立人胃癌細(xì)胞SGC-7901裸鼠移植瘤模型。3.2溫?zé)峄煷龠M腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平得到,結(jié)果表明,與control組細(xì)胞相比,熱療、化療和溫?zé)峄熅茱@著增加腫瘤細(xì)胞中ROS的含量,統(tǒng)計結(jié)果表明細(xì)胞受奧沙利鉑和溫度抑制作用的交互效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.573,P=0.065),奧沙利鉑和溫度的主效應(yīng)也均有統(tǒng)計學(xué)差異(F=34.687,P=0.000;F=116.970,P=0.000)。3.3溫?zé)峄煷龠M腫瘤細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達和細(xì)胞死亡Western blot和免疫組化實驗方法驗證腫瘤組織細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的表達與定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過熱療、化療與溫?zé)峄熖幚淼母鹘M腫瘤組織細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1、mTOR的表達量與細(xì)胞層面的結(jié)果一致,另外統(tǒng)計結(jié)果表明細(xì)胞受奧沙利鉑和溫度抑制作用的交互效應(yīng)有統(tǒng)計學(xué)意義,奧沙利鉑和溫度的主效應(yīng)也均有統(tǒng)計學(xué)差異。TUNEL法檢測各組腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),熱療、化療與溫?zé)峄熖幚矶寄艽龠M腫瘤組織細(xì)胞的凋亡水平增加。結(jié)論1.胃癌細(xì)胞產(chǎn)生ROS可使胃癌細(xì)胞自噬相關(guān)基因m-TOR表達下調(diào),Beclin 1、LC3B表達上調(diào),胃癌細(xì)胞ROS產(chǎn)生水平與胃癌細(xì)胞的自噬水平呈正相關(guān)；2.溫?zé)峄熣T導(dǎo)胃癌細(xì)胞ROS產(chǎn)生水平與殺傷胃癌細(xì)胞的效應(yīng)呈線性關(guān)系,表明溫?zé)峄煷碳の赴┘?xì)胞產(chǎn)生ROS在誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡中起重要作用；3.溫?zé)峄煷碳の赴┘?xì)胞產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞自噬性死亡在溫?zé)峄煔赴┘?xì)胞中起重要作用;
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【參考文獻】
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1 孫秀娣,牧人,周有尚,戴旭東,張思維,皇甫小梅,孫杰,李連弟,魯鳳珠,喬友林;中國胃癌死亡率20年變化情況分析及其發(fā)展趨勢預(yù)測[J];中華腫瘤雜志;2004年01期
，本文編號：2095759
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