本文選題：苯乙基異硫氰酸酯(PEITC) + 神經膠質瘤��； 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景人腦膠質瘤是最常見的原發(fā)中樞神經系統(tǒng)腫瘤,約占所有中樞神經系統(tǒng)腫瘤的30%,腦惡性腫瘤的80%。其較高的發(fā)病率和病死率使其成為顱內最難攻克的腫瘤。盡管目前人腦膠質瘤的診斷、手術治療、化學治療和放射治療等方面的有了一定提高,膠質母瘤的預后仍非常差,中位生存期一般只有12-15個月而且生活質量非常差。膠質瘤的癥狀取決于侵及的部位,可因顱內壓增高出現頭疼,嘔吐,癲癇發(fā)作,顱神經缺失等癥狀。外科手術結合放療和化療的綜合治療是目前主要治療手段。手術治療很難全切腫瘤,術后復發(fā)率很高。目前臨床上,替莫唑安(TMZ)作為一線化療藥物用于治療膠質母細胞瘤。但是由于血腦屏障、06-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(06-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)基因啟動子甲基化率低、多重抗藥性等因素,膠質母細胞瘤以替莫唑安為基本藥物的放化療效果也不理想。因此探索新的有效治療方法包括新的化療藥物治療膠質瘤迫在眉睫。選擇利用天然產物合成抗癌藥物具有成本低,易獲得,毒性小或無毒,且已經在中藥使用過等特點,越來越受到人們的重視。芥子油甙存在于所有十字花科植物中如西洋菜、西蘭花、甘藍等,借助于植物中葡糖硫苷酶作用,髓過切割和咀嚼等機械性損傷可將芥子油甙轉變?yōu)橛写_實生物活性的物質,即異硫氰酸鹽(isothiocyanates, ITCs)。異硫氰酸苯乙酉(phenthyl isothiocyanate,PEITC)則是以ITCs為基礎,通過人工合成的方式獲得的一種異硫氰酸化合物。以前的研究已經證實PEITC具有廣譜和明顯的抗腫瘤作用,他的機制是通過誘導細胞凋亡和逆轉化療藥物抗藥性。PEITC在惡性癌細胞具有強大的誘導活性氧產生作用,而在正常細胞沒有,因此可以選擇性殺死惡性癌細胞而不是相應的正常細胞。作為一個天然化合物,PEITC不像許多傳統(tǒng)的抗癌藥物,沒有呈現任何嚴重毒性反應。我們猜測PEITC對于惡性膠質瘤細胞是不是也有同樣的抗腫瘤作用。PEITC的抗癌活性可以分為化學預防作用和化學治療作用,世界上不同地方的多個流行病學研究提供很強的證據證明飲食攝入越多十字花科蔬菜,患癌癥的風險越小。雖然化學預防作用已經通過流行病學的證據被證實,而化學治療作用的詳細機制研究正在通過各種臨床前期試驗進行評估包括化學致癌模型及轉基因大鼠模型。PEITC的化學預防作用。一般癌癥的發(fā)生是由于致癌毒物的生物激活和階段Ⅰ藥物代謝酶的水解。因此調整階段Ⅰ酶可以影響致癌物的活性過程。PEITC顯示有雙重作用于階段Ⅰ酶,例如一方面誘導產生CYP1A1和CYP1A2,另一方面抑制某些細胞色素P450酶的活性如CYP2E1, CYP3A4和CYP2A3。階段Ⅱ酶在解毒和致癌中發(fā)揮重要作用。PEITC誘導階段Ⅱ解毒酶的產生,可以解釋它的化學預防作用。PEITC的化學治療作用,兩個被證實的主要機制是細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡。PEITC調整活性氧(ROS)的產生,導致細胞毒效應特別是癌細胞,也被認為是主要機制。ROS導致線粒體調整Bcl2, BID, BIM and BAX蛋白的表達,引起細胞色素C的釋放,誘導細胞凋亡。另一個誘導ROS毒性機制是抑制ROS的解毒作用,每個細胞都有良好的保護機制防止活性氧引起的損傷。首先是活性氧的清除機制包括超氧陰離子對氧及雙氧水的歧化作用。其次過氧化氫被谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)轉化成水或被過氧化氫酶分解為氧氣和水。谷胱甘肽(GSH)是GPX的一個底物。PEITC與GSH結合引起癌細胞內GSH的耗竭導致活性氧誘導的細胞損傷。有趣的是GSH的濃度與PEITC的敏感性有關,細胞內GSH的濃度越高對PEITC的敏感性相對也越高,這可能解釋對癌細胞和正常細胞的選擇性,因為癌細胞較正常細胞有更高水平的GSH。目的：腫瘤的發(fā)生發(fā)展非常復雜,涉及到多個基因和多個通路的紊亂,在國際上已引起了科學家們的高度重視。盡管近年來國內外在腫瘤的預防和治療研究方面取得了較大的進展,但是惡性腫瘤造成的患者死亡率仍然很高,對腫瘤的預防和治療仍然是醫(yī)學科研界面對的一大難題。因此提高腫瘤的治愈率或減少腫瘤的死亡率是顯著研究的重點。目前微創(chuàng)治療和靶向抗腫瘤藥物治療是治療腫瘤的發(fā)展趨勢,特別是開發(fā)高效且低毒的靶向藥物。近年來,隨著越來越深入的研究,對癌癥的化學預防方式備受關注。研究發(fā)現,人們日常食用的植物或水果中含有豐富的抗腫瘤成分,如葡萄中含有漆樹黃酮,綠茶中含有茶多酚,以及十字花科植物中含有的異硫氰酸酯等。流行病學研究已經表明,十字花科植物,如蘿卜、白菜、西蘭花、花椰菜以及芥菜等硫代葡萄糖苷含量都較高,當植物組織或植物細胞遭到外力被破壞后,細胞內的硫代葡萄糖苷會被細胞內自身的黑芥子酶水解產生具有抗癌活性的異硫氰酸酯。因此,增加十字花科植物的攝取會很大程度降低癌癥的發(fā)生率。異硫氰酸酯是一種具有強的刺激性氣味的物質,而且容易揮發(fā),容易溶于乙醚和乙醇等有機溶劑中,其穩(wěn)定性受環(huán)境酸堿度和溫度的影響較大。常見或研究較多的異硫氰酸酯類化合物包括苯乙基異硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate, PEITC)、烯丙基異硫氰酸酯、萊菔硫烷以及萊菔素等。在比較異硫氰酸酯和腈類物質的生物學活性時發(fā)現,異硫氰酸酯可以顯著的誘導Ⅱ型解毒酶的產生,而腈類物質不能。神經膠質瘤是一類中樞神經系統(tǒng)最常見的發(fā)生于人神經上皮的惡性腫瘤,其發(fā)病率、復發(fā)率和死亡率都較高,具有入侵快、治愈難和細胞異質性的特點。神經膠質瘤在原發(fā)性腦腫瘤中的比例高達40%～60%,根據分化程度的不同分為星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、膠質母細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤以及少突膠質細胞瘤等。神經膠質瘤分化成星形細胞瘤和膠質母細胞瘤的患者,其1年內的最大存活率僅為5%。由于神經膠質瘤具有分化能力差、侵襲能力強和增殖速率快等特點,常規(guī)采用的手術治療方法還不能徹底清除腫瘤細胞；另一方面,由于腫瘤細胞對長時間的輻射會產生耐受性從而導致殘余病灶的復發(fā)率高。此外,機體產生的腫瘤耐藥性和個體間的用藥差異性和腫瘤組織內及周邊水腫組織間隙的靜水壓高等因素都會降低化療的效果。此外,由于手術治療惡性膠質瘤特別是高分化的膠質瘤細胞的局限性,其發(fā)生率和死亡率都較高,且術后平均生存時間少于一年。因此,如何將神經膠質瘤細胞的完全清除仍然是研究者們面臨的一大難題,尋找新的治療方法至關重要。尋找能夠抑制被異常激活的神經膠質瘤信號通路的藥物是殺死腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞增殖,進而治療神經膠質瘤的有效手段之一。近年來,隨著對異硫氰酸酯(isothiocyanates, ITCs)的深入研究,其顯著的抗癌活性備受研究者們關注,已成為預防癌癥發(fā)生發(fā)展的最具潛力的天然功能因子之一。目前已經證明的具有抗腫瘤活性的異硫氰酸酯類化合物有二十余種。其中,蘿卜硫素(SFN, sulforaphane)可以抑制小鼠多種癌癥包括食道癌、胃癌、肝癌及膀胱癌的進展；而由N-亞硝基甲基一芐基胺(NB MA)、對由亞硝胺、苯并芘、甲基偶氮甲醇乙酸酯(MAM)、4-甲亞硝胺基-3-3吡啶-1-丁酮(NNK)等致癌物造成的小鼠肝癌、肺癌、腸道癌及食道癌會被苯甲基異硫氰酸酯(BITC, benzylisothiocyanate)和苯乙基異硫氰酸酯有效抑制。PEITC可顯著抑制吸煙造成的大鼠肺癌和食道癌的發(fā)生。目前公認的異硫氰酸酯的抗癌和抗腫瘤活性是通過降低階段Ⅰ酶或提高階段Ⅱ解毒酶的活性,從而提高機體對致癌物的代謝能力和解毒、脫毒能力實現的。另外,癌癥的發(fā)生發(fā)展與機體所受的氧化損傷程度也密切相關,具體表現為細胞內自由基含量的增加和相關氧化酶系的變化。苯乙基異硫氰酸酯是異硫氰酸酯家族成員之一,由于其具有顯著的化學預防作用而受到廣泛關注,是研究最廣泛的一種。多項研究已經證實苯乙基異硫氰酸酯具有顯著的抗肺癌和白血病細胞等的活性。因此,苯乙基異硫氰酸酯將會是最具有臨床應用前景的癌癥預防和治療的藥物之一。目前,美國安德森癌癥中心正在進行使用苯乙基異硫氰酸酯治療肺癌和乳腺癌的I期臨床試驗(專利號：NCICN-55120)。同時,明尼蘇達州立大學和Masonic腫瘤研究中心聯合國家癌癥中心也在展開苯乙基異硫氰酸酯治療肺癌的II期臨床試驗。本研究旨在探索苯乙基異硫氰酸酯對人類神經膠質瘤細胞LN229的生長影響極其影響機制,為將苯乙基異硫氰酸酯應用到預防和治療人神經膠質瘤提供依據。方法：本研究的研究對象是人神經膠質瘤LN229細胞,利用MTT試驗檢測PEITC對腫瘤細胞的生長和增殖的影響。MTT是一種黃色染料。在細胞線粒體內含有的琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的共同作用下,MTT被代謝還原為藍紫色且不溶于水的甲佨,通過測定490 nin處甲躦的含量就可推測活細胞的數量。通過Annexin-V-FITC/PI流式細胞術分析PEITC對神經膠質瘤細胞周期和細胞凋亡的影響。Annexin-V是一種依賴于Ca2+的磷脂結合蛋白,當在Ca2+存在條件下,Annexin-V可以與細胞表面的磷脂酰絲氨酸結合,使磷脂酰絲氨酸暴露在細胞膜外標志著細胞凋亡的開始；PI是一種DNA染料,當細胞進入凋亡晚期后,細胞膜的通透性會發(fā)生變化,此時PI進入細胞并與細胞內的DNA結合,因此,通過Annexin-V/PI雙染色法就可以檢測到細胞凋亡,分析細胞內的DNA含量的不同研究細胞周期的變化。利用DCFH-DA探針法檢測腫瘤細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)的表達水平。DCFH-DA探針是用于特異的鑒定細胞內ROS含量,其可以穿過細胞膜并被酯酶催化水解形成DCFH,而細胞內的ROS可以將無熒光標記的DCFH轉變?yōu)橛袩晒鈽擞浀腄CF。所以,通過檢測細胞內DCF的熒光強度就可以鑒定細胞內ROS的水平變化。同時通過酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELI SA)檢測用PEITC處理后,腫瘤細胞內超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活性。采用western blot法檢測含半胱氨酸的天冬氨酸酪蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, Caspase-3)活性的變化。結果：當PEITC作用于神經膠質瘤LN229細胞72小時后,細胞的生長受到顯著抑制,且這種抑制作用具有PEITC濃度依賴性(IC50=20uM)。結果還顯示,當濃度分別為10μM和20 μM的PEITC時,PEITC對細胞生長的抑制率較高,而且對正常細胞表現出無毒或弱毒性。因此,在接下來的研究中本文選擇的PEITC濃度分別為10μM和20μM。流式細胞術分析PEITC對神經膠質瘤LN229細胞凋亡的影響,結果顯示：分別用10μM和20 μM的PEITC處理LN229細胞24小時后,對照組的細胞凋亡率僅為5%；10 gM的PEITC處理后細胞凋亡率為30.3%(P0.05)；而20μM的PEITC處理后細胞凋亡率高達64.9%(P0.05)。同時,流式細胞術分析結果還顯示處于G2/M期的細胞比例明顯上升,而G0/G1期的細胞比例明顯下降(P0.05)。對ROS表達水平的檢測結果顯示101μMPEITC組細胞的ROS表達量比對照組高4倍,而20 μM PEITC組細胞的ROS表達量比對照組高6倍,且統(tǒng)計分析具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。此外,用10μM和20μM的PEITC分別處理LN229細胞24小時后,腫瘤細胞內GSH和SOD的表達水平明顯降低。10μM PEITC組20 μM PEITC組細胞內的GSH表達量與對照組細胞GSH表達量相比僅為69.3%和42.4%(P0.05)；而10 μM PEITC組和20 μM PEITC組細胞內的SOD表達量與對照組細胞SOD表達量相比僅為60.7%和20.6%(P0.05)；而且腫瘤細胞內caspase-3的活性與對照組(β-actin)相比顯著增加(P0.05)。結論：PEITC具有抑制神經膠質瘤細胞LN229生長、促進凋亡以及阻滯細胞周期的功能；而且PEITC顯著增加腫瘤細胞內的ROS水平,并抑制SOD和GSH的表達,從而誘導caspase-3的降解/活化,最終加速腫瘤細胞的死亡。此外,由于PEITC主要是來自于人們日常食用的蔬菜,所以PEITC對正常細胞表現為弱毒或無毒。因此,PEITC將會是一種安全、無毒或低毒且有效的抗膠質瘤藥物,可能具有一定的市場應用前景。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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