發(fā)布時(shí)間：2018-07-03 13:54

  本文選題：苯乙基異硫氰酸酯(PEITC) + 神經(jīng)膠質(zhì)瘤��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景人腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,約占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%,腦惡性腫瘤的80%。其較高的發(fā)病率和病死率使其成為顱內(nèi)最難攻克的腫瘤。盡管目前人腦膠質(zhì)瘤的診斷、手術(shù)治療、化學(xué)治療和放射治療等方面的有了一定提高,膠質(zhì)母瘤的預(yù)后仍非常差,中位生存期一般只有12-15個月而且生活質(zhì)量非常差。膠質(zhì)瘤的癥狀取決于侵及的部位,可因顱內(nèi)壓增高出現(xiàn)頭疼,嘔吐,癲癇發(fā)作,顱神經(jīng)缺失等癥狀。外科手術(shù)結(jié)合放療和化療的綜合治療是目前主要治療手段。手術(shù)治療很難全切腫瘤,術(shù)后復(fù)發(fā)率很高。目前臨床上,替莫唑安(TMZ)作為一線化療藥物用于治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。但是由于血腦屏障、06-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(06-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)基因啟動子甲基化率低、多重抗藥性等因素,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以替莫唑安為基本藥物的放化療效果也不理想。因此探索新的有效治療方法包括新的化療藥物治療膠質(zhì)瘤迫在眉睫。選擇利用天然產(chǎn)物合成抗癌藥物具有成本低,易獲得,毒性小或無毒,且已經(jīng)在中藥使用過等特點(diǎn),越來越受到人們的重視。芥子油甙存在于所有十字花科植物中如西洋菜、西蘭花、甘藍(lán)等,借助于植物中葡糖硫苷酶作用,髓過切割和咀嚼等機(jī)械性損傷可將芥子油甙轉(zhuǎn)變?yōu)橛写_實(shí)生物活性的物質(zhì),即異硫氰酸鹽(isothiocyanates, ITCs)。異硫氰酸苯乙酉(phenthyl isothiocyanate,PEITC)則是以ITCs為基礎(chǔ),通過人工合成的方式獲得的一種異硫氰酸化合物。以前的研究已經(jīng)證實(shí)PEITC具有廣譜和明顯的抗腫瘤作用,他的機(jī)制是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和逆轉(zhuǎn)化療藥物抗藥性。PEITC在惡性癌細(xì)胞具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生作用,而在正常細(xì)胞沒有,因此可以選擇性殺死惡性癌細(xì)胞而不是相應(yīng)的正常細(xì)胞。作為一個天然化合物,PEITC不像許多傳統(tǒng)的抗癌藥物,沒有呈現(xiàn)任何嚴(yán)重毒性反應(yīng)。我們猜測PEITC對于惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞是不是也有同樣的抗腫瘤作用。PEITC的抗癌活性可以分為化學(xué)預(yù)防作用和化學(xué)治療作用,世界上不同地方的多個流行病學(xué)研究提供很強(qiáng)的證據(jù)證明飲食攝入越多十字花科蔬菜,患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)越小。雖然化學(xué)預(yù)防作用已經(jīng)通過流行病學(xué)的證據(jù)被證實(shí),而化學(xué)治療作用的詳細(xì)機(jī)制研究正在通過各種臨床前期試驗(yàn)進(jìn)行評估包括化學(xué)致癌模型及轉(zhuǎn)基因大鼠模型。PEITC的化學(xué)預(yù)防作用。一般癌癥的發(fā)生是由于致癌毒物的生物激活和階段Ⅰ藥物代謝酶的水解。因此調(diào)整階段Ⅰ酶可以影響致癌物的活性過程。PEITC顯示有雙重作用于階段Ⅰ酶,例如一方面誘導(dǎo)產(chǎn)生CYP1A1和CYP1A2,另一方面抑制某些細(xì)胞色素P450酶的活性如CYP2E1, CYP3A4和CYP2A3。階段Ⅱ酶在解毒和致癌中發(fā)揮重要作用。PEITC誘導(dǎo)階段Ⅱ解毒酶的產(chǎn)生,可以解釋它的化學(xué)預(yù)防作用。PEITC的化學(xué)治療作用,兩個被證實(shí)的主要機(jī)制是細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PEITC調(diào)整活性氧(ROS)的產(chǎn)生,導(dǎo)致細(xì)胞毒效應(yīng)特別是癌細(xì)胞,也被認(rèn)為是主要機(jī)制。ROS導(dǎo)致線粒體調(diào)整Bcl2, BID, BIM and BAX蛋白的表達(dá),引起細(xì)胞色素C的釋放,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另一個誘導(dǎo)ROS毒性機(jī)制是抑制ROS的解毒作用,每個細(xì)胞都有良好的保護(hù)機(jī)制防止活性氧引起的損傷。首先是活性氧的清除機(jī)制包括超氧陰離子對氧及雙氧水的歧化作用。其次過氧化氫被谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)轉(zhuǎn)化成水或被過氧化氫酶分解為氧氣和水。谷胱甘肽(GSH)是GPX的一個底物。PEITC與GSH結(jié)合引起癌細(xì)胞內(nèi)GSH的耗竭導(dǎo)致活性氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。有趣的是GSH的濃度與PEITC的敏感性有關(guān),細(xì)胞內(nèi)GSH的濃度越高對PEITC的敏感性相對也越高,這可能解釋對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的選擇性,因?yàn)榘┘?xì)胞較正常細(xì)胞有更高水平的GSH。目的：腫瘤的發(fā)生發(fā)展非常復(fù)雜,涉及到多個基因和多個通路的紊亂,在國際上已引起了科學(xué)家們的高度重視。盡管近年來國內(nèi)外在腫瘤的預(yù)防和治療研究方面取得了較大的進(jìn)展,但是惡性腫瘤造成的患者死亡率仍然很高,對腫瘤的預(yù)防和治療仍然是醫(yī)學(xué)科研界面對的一大難題。因此提高腫瘤的治愈率或減少腫瘤的死亡率是顯著研究的重點(diǎn)。目前微創(chuàng)治療和靶向抗腫瘤藥物治療是治療腫瘤的發(fā)展趨勢,特別是開發(fā)高效且低毒的靶向藥物。近年來,隨著越來越深入的研究,對癌癥的化學(xué)預(yù)防方式備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),人們?nèi)粘Ｊ秤玫闹参锘蛩泻胸S富的抗腫瘤成分,如葡萄中含有漆樹黃酮,綠茶中含有茶多酚,以及十字花科植物中含有的異硫氰酸酯等。流行病學(xué)研究已經(jīng)表明,十字花科植物,如蘿卜、白菜、西蘭花、花椰菜以及芥菜等硫代葡萄糖苷含量都較高,當(dāng)植物組織或植物細(xì)胞遭到外力被破壞后,細(xì)胞內(nèi)的硫代葡萄糖苷會被細(xì)胞內(nèi)自身的黑芥子酶水解產(chǎn)生具有抗癌活性的異硫氰酸酯。因此,增加十字花科植物的攝取會很大程度降低癌癥的發(fā)生率。異硫氰酸酯是一種具有強(qiáng)的刺激性氣味的物質(zhì),而且容易揮發(fā),容易溶于乙醚和乙醇等有機(jī)溶劑中,其穩(wěn)定性受環(huán)境酸堿度和溫度的影響較大。常見或研究較多的異硫氰酸酯類化合物包括苯乙基異硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate, PEITC)、烯丙基異硫氰酸酯、萊菔硫烷以及萊菔素等。在比較異硫氰酸酯和腈類物質(zhì)的生物學(xué)活性時(shí)發(fā)現(xiàn),異硫氰酸酯可以顯著的誘導(dǎo)Ⅱ型解毒酶的產(chǎn)生,而腈類物質(zhì)不能。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的發(fā)生于人神經(jīng)上皮的惡性腫瘤,其發(fā)病率、復(fù)發(fā)率和死亡率都較高,具有入侵快、治愈難和細(xì)胞異質(zhì)性的特點(diǎn)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤在原發(fā)性腦腫瘤中的比例高達(dá)40%～60%,根據(jù)分化程度的不同分為星形細(xì)胞瘤、間變性星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤以及少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤等。神經(jīng)膠質(zhì)瘤分化成星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者,其1年內(nèi)的最大存活率僅為5%。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有分化能力差、侵襲能力強(qiáng)和增殖速率快等特點(diǎn),常規(guī)采用的手術(shù)治療方法還不能徹底清除腫瘤細(xì)胞；另一方面,由于腫瘤細(xì)胞對長時(shí)間的輻射會產(chǎn)生耐受性從而導(dǎo)致殘余病灶的復(fù)發(fā)率高。此外,機(jī)體產(chǎn)生的腫瘤耐藥性和個體間的用藥差異性和腫瘤組織內(nèi)及周邊水腫組織間隙的靜水壓高等因素都會降低化療的效果。此外,由于手術(shù)治療惡性膠質(zhì)瘤特別是高分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的局限性,其發(fā)生率和死亡率都較高,且術(shù)后平均生存時(shí)間少于一年。因此,如何將神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的完全清除仍然是研究者們面臨的一大難題,尋找新的治療方法至關(guān)重要。尋找能夠抑制被異常激活的神經(jīng)膠質(zhì)瘤信號通路的藥物是殺死腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞增殖,進(jìn)而治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有效手段之一。近年來,隨著對異硫氰酸酯(isothiocyanates, ITCs)的深入研究,其顯著的抗癌活性備受研究者們關(guān)注,已成為預(yù)防癌癥發(fā)生發(fā)展的最具潛力的天然功能因子之一。目前已經(jīng)證明的具有抗腫瘤活性的異硫氰酸酯類化合物有二十余種。其中,蘿卜硫素(SFN, sulforaphane)可以抑制小鼠多種癌癥包括食道癌、胃癌、肝癌及膀胱癌的進(jìn)展；而由N-亞硝基甲基一芐基胺(NB MA)、對由亞硝胺、苯并芘、甲基偶氮甲醇乙酸酯(MAM)、4-甲亞硝胺基-3-3吡啶-1-丁酮(NNK)等致癌物造成的小鼠肝癌、肺癌、腸道癌及食道癌會被苯甲基異硫氰酸酯(BITC, benzylisothiocyanate)和苯乙基異硫氰酸酯有效抑制。PEITC可顯著抑制吸煙造成的大鼠肺癌和食道癌的發(fā)生。目前公認(rèn)的異硫氰酸酯的抗癌和抗腫瘤活性是通過降低階段Ⅰ酶或提高階段Ⅱ解毒酶的活性,從而提高機(jī)體對致癌物的代謝能力和解毒、脫毒能力實(shí)現(xiàn)的。另外,癌癥的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體所受的氧化損傷程度也密切相關(guān),具體表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)自由基含量的增加和相關(guān)氧化酶系的變化。苯乙基異硫氰酸酯是異硫氰酸酯家族成員之一,由于其具有顯著的化學(xué)預(yù)防作用而受到廣泛關(guān)注,是研究最廣泛的一種。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)苯乙基異硫氰酸酯具有顯著的抗肺癌和白血病細(xì)胞等的活性。因此,苯乙基異硫氰酸酯將會是最具有臨床應(yīng)用前景的癌癥預(yù)防和治療的藥物之一。目前,美國安德森癌癥中心正在進(jìn)行使用苯乙基異硫氰酸酯治療肺癌和乳腺癌的I期臨床試驗(yàn)(專利號：NCICN-55120)。同時(shí),明尼蘇達(dá)州立大學(xué)和Masonic腫瘤研究中心聯(lián)合國家癌癥中心也在展開苯乙基異硫氰酸酯治療肺癌的II期臨床試驗(yàn)。本研究旨在探索苯乙基異硫氰酸酯對人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN229的生長影響極其影響機(jī)制,為將苯乙基異硫氰酸酯應(yīng)用到預(yù)防和治療人神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供依據(jù)。方法：本研究的研究對象是人神經(jīng)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞,利用MTT試驗(yàn)檢測PEITC對腫瘤細(xì)胞的生長和增殖的影響。MTT是一種黃色染料。在細(xì)胞線粒體內(nèi)含有的琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的共同作用下,MTT被代謝還原為藍(lán)紫色且不溶于水的甲佨,通過測定490 nin處甲躦的含量就可推測活細(xì)胞的數(shù)量。通過Annexin-V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)分析PEITC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。Annexin-V是一種依賴于Ca2+的磷脂結(jié)合蛋白,當(dāng)在Ca2+存在條件下,Annexin-V可以與細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合,使磷脂酰絲氨酸暴露在細(xì)胞膜外標(biāo)志著細(xì)胞凋亡的開始；PI是一種DNA染料,當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡晚期后,細(xì)胞膜的通透性會發(fā)生變化,此時(shí)PI進(jìn)入細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合,因此,通過Annexin-V/PI雙染色法就可以檢測到細(xì)胞凋亡,分析細(xì)胞內(nèi)的DNA含量的不同研究細(xì)胞周期的變化。利用DCFH-DA探針法檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)的表達(dá)水平。DCFH-DA探針是用于特異的鑒定細(xì)胞內(nèi)ROS含量,其可以穿過細(xì)胞膜并被酯酶催化水解形成DCFH,而細(xì)胞內(nèi)的ROS可以將無熒光標(biāo)記的DCFH轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒鈽?biāo)記的DCF。所以,通過檢測細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度就可以鑒定細(xì)胞內(nèi)ROS的水平變化。同時(shí)通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELI SA)檢測用PEITC處理后,腫瘤細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活性。采用western blot法檢測含半胱氨酸的天冬氨酸酪蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, Caspase-3)活性的變化。結(jié)果：當(dāng)PEITC作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞72小時(shí)后,細(xì)胞的生長受到顯著抑制,且這種抑制作用具有PEITC濃度依賴性(IC50=20uM)。結(jié)果還顯示,當(dāng)濃度分別為10μM和20 μM的PEITC時(shí),PEITC對細(xì)胞生長的抑制率較高,而且對正常細(xì)胞表現(xiàn)出無毒或弱毒性。因此,在接下來的研究中本文選擇的PEITC濃度分別為10μM和20μM。流式細(xì)胞術(shù)分析PEITC對神經(jīng)膠質(zhì)瘤LN229細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示：分別用10μM和20 μM的PEITC處理LN229細(xì)胞24小時(shí)后,對照組的細(xì)胞凋亡率僅為5%；10 gM的PEITC處理后細(xì)胞凋亡率為30.3%(P0.05)；而20μM的PEITC處理后細(xì)胞凋亡率高達(dá)64.9%(P0.05)。同時(shí),流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果還顯示處于G2/M期的細(xì)胞比例明顯上升,而G0/G1期的細(xì)胞比例明顯下降(P0.05)。對ROS表達(dá)水平的檢測結(jié)果顯示101μMPEITC組細(xì)胞的ROS表達(dá)量比對照組高4倍,而20 μM PEITC組細(xì)胞的ROS表達(dá)量比對照組高6倍,且統(tǒng)計(jì)分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。此外,用10μM和20μM的PEITC分別處理LN229細(xì)胞24小時(shí)后,腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH和SOD的表達(dá)水平明顯降低。10μM PEITC組20 μM PEITC組細(xì)胞內(nèi)的GSH表達(dá)量與對照組細(xì)胞GSH表達(dá)量相比僅為69.3%和42.4%(P0.05)；而10 μM PEITC組和20 μM PEITC組細(xì)胞內(nèi)的SOD表達(dá)量與對照組細(xì)胞SOD表達(dá)量相比僅為60.7%和20.6%(P0.05)；而且腫瘤細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活性與對照組(β-actin)相比顯著增加(P0.05)。結(jié)論：PEITC具有抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN229生長、促進(jìn)凋亡以及阻滯細(xì)胞周期的功能；而且PEITC顯著增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,并抑制SOD和GSH的表達(dá),從而誘導(dǎo)caspase-3的降解/活化,最終加速腫瘤細(xì)胞的死亡。此外,由于PEITC主要是來自于人們?nèi)粘Ｊ秤玫氖卟?所以PEITC對正常細(xì)胞表現(xiàn)為弱毒或無毒。因此,PEITC將會是一種安全、無毒或低毒且有效的抗膠質(zhì)瘤藥物,可能具有一定的市場應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳贊,楊立莊,葉偉,王伊龍,趙鵬,李永利,康軍,鄭永日,曹陽;神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞熱休克蛋白抗原肽復(fù)合物的研究[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2003年05期

2 陳贊 ,楊立莊 ,葉偉;神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞熱休克蛋白抗原肽復(fù)合物的研究[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2003年05期

3 張玲華;;神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷與治療現(xiàn)狀[J];實(shí)用醫(yī)技雜志;2007年24期

4 周文光;李南華;王廷芳;;鼻內(nèi)型神經(jīng)膠質(zhì)瘤一例[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;1990年02期

5 ;顱面神經(jīng)膠質(zhì)瘤[J];國外醫(yī)學(xué).耳鼻咽喉科學(xué)分冊;1997年02期

6 薛德麟,雷霆;要重視神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療[J];中國臨床神經(jīng)外科雜志;2002年01期

7 肖敏 ,吳淼 ,曾冬竹 ,饒蕓;樹突狀細(xì)胞瘤苗誘導(dǎo)的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤作用體外實(shí)驗(yàn)研究[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2003年01期

8 戴捷,于\，

本文編號：2093879