本文選題：質譜 + 人絨毛膜促性腺激素��； 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：盡管現代科學已在癌癥疾病的研究中取得了長足的進步,但它依然是人類最主要的致死因素。早期診斷對于癌癥的治療非常關鍵,它可以顯著提高癌癥的治療效果和病人的存活率。癌癥生物標志物通常是與疾病相關的特異性內源生物分子,通過監(jiān)測其濃度可以獲得疾病的相關信息,它們在癌癥的早期診斷和治療過程中發(fā)揮著非常重要的作用。癌癥生物標志物通常用于癌癥的篩查、診斷和療效評價,同時也可以用于評估癌癥病人的預后情況。FDA已批準用于癌癥的診斷及給藥后藥物反應監(jiān)測的生物標志物大部分是糖蛋白。糖蛋白是由寡糖鏈通過共價鍵連接至蛋白的多肽側鏈而形成的,它們參與著許多關鍵的生物學過程。異常糖基化的蛋白在癌癥的發(fā)病過程中扮演著非常關鍵的角色,它們中很多是癌癥疾病的生物標志物。人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin, hCG)是一種非常重要的糖蛋白激素,主要由胎盤合體滋養(yǎng)層細胞合成。它是由α亞基和β亞基通過非共價的疏水和離子相互作用力結合而成的異二聚體。過糖基化hCG(Hyper-glycosylated hCG, hCG-H)是異常糖基化的hCG,其N-糖鏈由于發(fā)生了所謂的“過糖基化”,結構變得更加復雜。hCG-H主要由著床期的滋養(yǎng)層細胞和絨毛膜癌組織分泌,在多種生殖細胞腫瘤的侵襲和生長過程中發(fā)揮著重要作用,是一種重要的癌癥生物標志物。如果在準確并快速測定hCG濃度的同時能夠監(jiān)測其N-糖鏈是否發(fā)生過糖基化,可增加相關癌癥疾病的診斷的準確率和靈敏度。目前市面上雖然有多種針對hCG的免疫診斷產品,但并不能滿足診斷需求,主要表現為：1)現有的免疫診斷產品通�；谝粋�假設,即hCG與抗體的結合能力不受其N-糖基化的影響,并未考慮N-糖基化的個體差異可能導致測定結果出現偏差。2)目前的診斷產品只局限于分析樣品中hCG的含量,無法辨別病人的hCG的N-糖基化有無異常。要解決上述問題,關鍵是篩選到可以區(qū)分hCG與hCG-H的單克隆抗體。本論文的目標之一就是篩選出能夠特異性辨別hCG與hCG-H的單克隆抗體,并采用質譜技術分析這些抗體與抗原相互作用的抗原表位,從抗原表位與糖鏈空間位置關系的角度闡明糖基化影響抗體親和力的機理,為腫瘤糖蛋白生物標志物的抗體篩選提供重要理論依據,并為研發(fā)新一代hCG免疫診斷試劑盒奠定基礎。低分子肝素是通過化學方法或酶法解聚肝素而制備的寡糖藥物,在臨床上主要用于防治深靜脈血栓、肺動脈血栓等。近年來的研究表明低分子肝素還具有抑制惡性腫瘤細胞增殖、誘導惡性腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤血管生成等活性,是一種非常具有潛力的抗腫瘤藥物。低分子肝素的寡糖組分非常復雜,具有很強的異質性,結構表征對于其工藝優(yōu)化、安全性評價及仿制藥物申報都至關重要,建立一種靈敏并且高效的質譜分析方法具有非常重要的實用價值。本論文的另一重要目標是建立一種適用于低分子肝素的液相色譜與質譜聯用分析方法。本論文的主要研究成果如下：1.建立了一種從生物樣本中純化hCG的方法我們將過濾、超濾與免疫親和層析等方法結合,建立了一種從生物樣品中純化hCG的方法。SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示,從侵襲性葡萄胎病人尿液樣品中純化的hCG的條帶更加彌散,表明該樣品可能發(fā)生了過糖基化。膠內酶解和質譜鑒定的結果表明純化的蛋白確為hCG。2.對hCG的糖基化位點及N-糖鏈組成進行了比較細致的分析用Trypsin將hCG酶切成肽段,然后用各種寡糖外切酶對O-糖鏈的糖單元進行逐個修剪,最終只保留一個GalNAc標簽,然后對肽段樣品進行nanoLC-MS/MS分析,我們首次發(fā)現a亞基的Thr-54也會發(fā)生O-糖基化。采用PNGase F分別釋放hCG和hCG-H的N-糖鏈,樣品經多孔石墨化碳(Porous graphitized carbon, PGC)固相萃取柱純化后進行PGC-ESI-MS分析。我們發(fā)現hCG-H的多分支寡糖鏈(主要是四分支寡糖鏈)比例增加,表明從侵襲性葡萄胎尿液樣本中純化得到的hCG-H發(fā)生了過糖基化。3.篩選出受hCG糖基化狀態(tài)影響和不受hCG糖基化狀態(tài)影響的單克隆抗體采用生物膜光干涉技術(Bio-layer Interferometry, BLI)測定不同單克隆抗體與hCG和hCG-H的親和解離常數(KD值)。我們發(fā)現MCA329與hCG和hCG-H的KD值接近,說明MCA329與hCG的結合不受抗原糖基化狀態(tài)的影響；MCA1024與hCG的KD值遠小于其與hCG-H的KD值,表明MCA1024與正常的hCG的結合力更強,其與hCG的結合受其糖基化狀態(tài)的影響。4.采用氫／氘交換與質譜聯用的方法分析hCG不同單克隆抗體的抗原表位采用氫/氘交換與質譜聯用的方法分析MCA329和MCA1024與hCG相互作用的抗原表位。當hCGβ與MCA329結合后,β65-77、β78-83和β116-133這三條肽段氘的交換效率明顯降低。hCGβ亞基C-末端肽段(β109-145)的缺失并不影響針對β2表位的抗體結合,這說明MCA329的抗原表位并不包含β116-133肽段。β116-133交換效率下降是因為MCA329從靠近C-末端肽段的方向與β65-83發(fā)卡結構的一端結合,限制了p116-133自由轉動導致其交換效率下降。當hCGβ與MCA1024結合后,β65-77和β78-83這兩條肽段氘的交換效率明顯降低,說明MCA1024的抗原表位同樣位于β65-83區(qū)域。MCA1024的親和力受hCG的糖基化狀態(tài)的影響,而3個N-糖基化位點(α亞基的Asn-52、β亞基的Asn-13和Asn-30)位于β65-83發(fā)卡結構另一端的兩側。位點特異性N-糖鏈分析結果表明：hCG-H中僅β亞基的Asn-13和Asn-30位點發(fā)生了明顯的過糖基化,α亞基的Asn-52并未發(fā)生過糖基化。我們推測β亞基的Asn-13和Asn-30的過糖基化導致MCA1024的親和力下降。我們采用PNGase F將hCG-H部分脫N-糖鏈后,MCA1024的親和力提高,這一結果證明了我們的推斷。5.建立了一種低分子肝素完整糖鏈的質譜分析方法我們建立了一種低分子肝素完整糖鏈的反相離子對色譜與高分辨質譜聯用(Reversed phase ion pair electrospray ionization mass spectrometry, RPIP-ESI-MS)分析方法,采用該方法不僅可以獲得低分子肝素樣品的高分離度TIC指紋譜圖,還能對樣品中的各種寡糖組分進行分析。結合我們開發(fā)的半自動譜圖解析軟件,分別可以從依諾肝素和那曲肝素中鑒定到從四糖至二十六糖的140多種和80種組分,各組分的誤差均在20 ppm以內。此外,該方法還可用于樣品中微量雜質的鑒定。
[Abstract]:Although modern science has made considerable progress in the study of cancer , it is still the main lethal factor for cancer . Early diagnosis is crucial for cancer treatment . It plays a very important role in the early diagnosis and treatment of cancer . Cancer biomarkers are usually used for cancer screening , diagnosis and efficacy evaluation , and are also useful for assessing the prognosis of cancer patients . In recent years , it has been shown that low molecular weight heparin can inhibit the proliferation of malignant tumor cells , induce malignant tumor cell apoptosis and inhibit tumor angiogenesis .
The exchange efficiency of 尾 65 - 77 , 尾 78 - 83 and 尾 116 - 133 was significantly lower than that of 尾 65 - 83 . When hCG 尾 was combined with MCA1024 , 尾 65 - 77 , Asn - 13 and Asn - 30 of 尾 - subunit were not affected by glycosylation .
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.43
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本文編號：2065346