本文選題：肝細(xì)胞癌 + 性別決定區(qū)Y框蛋白2��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:探討SOX2和PD-L1在肝癌中的表達(dá)、功能以及SOX2轉(zhuǎn)錄激活PD-L1在促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制。方法:采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)、免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫組化染色檢測(cè)SOX2和PD-L1在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)、免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫熒光檢測(cè)SOX2和PD-L1在三種肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系中的表達(dá)。利用siRNA的方法敲低SOX2在兩種SOX2高表達(dá)肝癌細(xì)胞系中的表達(dá),并比較在敲低SOX2基因前后這兩種細(xì)胞系的增殖能力和細(xì)胞凋亡狀態(tài)。通過實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增和免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SOX2在SOX2特定siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)是否減少,利用CCK8和EdU染色評(píng)估SOX2缺失對(duì)細(xì)胞增殖的影響。使用TRANSFAC數(shù)據(jù)庫研究PD-L1啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子SOX2結(jié)合位點(diǎn),在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-757bp處發(fā)現(xiàn)了一個(gè)一致性SOX2基序后,做關(guān)于包含啟動(dòng)子區(qū)域的SOX2基序的電泳遷移率實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫定量PCR實(shí)驗(yàn)來探討SOX2是否直接通過SOX2基序結(jié)合到PD-L1的基因啟動(dòng)子區(qū)。利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證SOX2是否通過上述SOX2結(jié)合位點(diǎn)激活PD-L1的調(diào)節(jié)區(qū)域。結(jié)果:不論是在mRNA水平還是在蛋白質(zhì)水平,SOX2和PD-L1在肝癌組織中的表達(dá)都顯著高于癌旁組織,二者的mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r = 0.692)。SOX2和PD-L1在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于正常肝細(xì)胞系。利用siRNA的方法敲低SOX2在兩種SOX2高表達(dá)肝癌細(xì)胞系中的表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)SOX2在SOX2特定siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)減少。CCK8和EdU染色觀察到肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC7721在轉(zhuǎn)染了 siSOX2后,其細(xì)胞增殖顯著減少,敲低SOX2基因也導(dǎo)致了肝癌細(xì)胞的凋亡。使用TRANSFAC數(shù)據(jù)庫研究PD-L1啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-757bp區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)一致性SOX2基序。包含啟動(dòng)子區(qū)域的SOX2基序的電泳遷移率實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)一個(gè)含有SOX2基序的22 bp的探針與從HepG2細(xì)胞系中提取出來的細(xì)胞核共孵育時(shí),一個(gè)特別的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物出現(xiàn)了并且被抗SOX2抗體超遷移。這表明SOX2是直接通過SOX2基序結(jié)合到PD-L1的基因啟動(dòng)子區(qū)的,通過在肝癌HepG2細(xì)胞系中進(jìn)行的染色質(zhì)免疫定量PCR實(shí)驗(yàn)得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證。利用HEK-293T細(xì)胞進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),克隆了包含SOX2基序和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的PD-L1基因啟動(dòng)子到熒光素酶質(zhì)粒中(pGL3-PD-L1),構(gòu)建了一個(gè)pGL3-PD-L1突變質(zhì)粒。SOX2基因共表達(dá)導(dǎo)致PD-L1基因啟動(dòng)子區(qū)顯著激活,在當(dāng)PD-L1啟動(dòng)子突變時(shí),SOX2在PD-L1啟動(dòng)子區(qū)域的反式激活能力明顯降低。結(jié)論:SOX2和PD-L1在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平比癌旁組織和正常肝細(xì)胞系高,二者在肝癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。在功能上,敲低SOX2可以降低肝癌細(xì)胞的活性,阻止肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡。通過直接結(jié)合到位于PD-L1啟動(dòng)子區(qū)域的SOX2基序,SOX2調(diào)控PD-L1的表達(dá)并調(diào)節(jié)PD-L1基因啟動(dòng)子的活性。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of SOX2 and PD - L1 in hepatocellular carcinoma ( HCC ) and its mechanism by means of real - time fluorescence quantitative nucleic acid amplification , Western blot and immunohistochemical staining . The expression of SOX2 and PD - L1 in human hepatocellular carcinoma cell lines was significantly decreased . The expression of SOX2 in HCC cell line was reduced . The results showed that SOX2 was directly linked to the gene promoter region of PD - L1 by SOX2 motif . The results showed that SOX2 was directly linked to the promoter region of PD - L1 by SOX2 .
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2065119