發(fā)布時(shí)間：2018-06-21 04:02

  本文選題：神經(jīng)酰胺類似物 + 髓系來源的抑制細(xì)胞(MDSCs)��； 參考：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：腫瘤免疫治療是利用免疫學(xué)原理和方法,對(duì)機(jī)體本身的免疫功能進(jìn)行激發(fā)和增強(qiáng),從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。目前研究免疫療法對(duì)抗癌癥的方法中較有進(jìn)展的是單克隆抗體療法、癌癥疫苗療法和免疫細(xì)胞療法。在2013年的《科學(xué)》雜志上,腫瘤免疫治療被評(píng)為年度十大科學(xué)進(jìn)展的第一位。然而,盡管機(jī)體有多種抗腫瘤免疫應(yīng)答,但腫瘤仍可在體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展,并且隨著腫瘤的增長(zhǎng),腫瘤細(xì)胞能產(chǎn)生一些細(xì)胞因子。這些因子可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一些抑制免疫的細(xì)胞,從而抑制抗腫瘤的免疫功能。免疫抑制細(xì)胞包括未成熟的樹突狀細(xì)胞(iDC)、腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(TAM)、骨髓來源的抑制細(xì)胞(MDSC)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg).具有生物活性的鞘脂類代謝產(chǎn)物,特別是神經(jīng)酰胺(Cer),鞘氨醇(Sph)和1-磷酸鞘氨醇(S1P),作為重要的生物效應(yīng)分子,參與調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)錄,引起細(xì)胞增值或死亡。近年來關(guān)于神經(jīng)酰胺類似物的研究發(fā)展較迅速,人們發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)酰胺類似物在抗腫瘤研究中存在較大潛力。但是這些類似物在腫瘤免疫抑制細(xì)胞中的作用機(jī)制是十分不清楚的。本論文從體內(nèi)和體外環(huán)境下,考察神經(jīng)酰胺類似物對(duì)腫瘤免疫抑制細(xì)胞的作用,并探究這一過程中比較完善的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,這可能為進(jìn)一步深入闡明神經(jīng)酰胺類似物在腫瘤免疫逃避中的作用機(jī)制提出新的觀點(diǎn),并可能為研發(fā)針對(duì)腫瘤免疫抑制細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療方法提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本文的主要研究結(jié)論如下：1.荷瘤小鼠中CD11b+ Gr1+MDSCs的比例升高,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。轉(zhuǎn)移性肉瘤細(xì)胞CMS4-met接種在BALB/c小鼠的皮下,一個(gè)月后,經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析,與未接種腫瘤的空白對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和血細(xì)胞中CD11b+ Gr1+MDSCs細(xì)胞比例明顯提高。這表明腫瘤相關(guān)的免疫抑制細(xì)胞的增加會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。2.神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521在動(dòng)物模型中降低了脾和腫瘤組織中CDllb+Gr1+MDSCs的百分比,抑制腫瘤的生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)移性肉瘤細(xì)胞CMS4-met接種在BALB/c小鼠的皮下,一個(gè)月后,靜脈注射LCL521 (75mg/kg.bw)兩次,每隔一天一次,采集得到荷瘤小鼠對(duì)照組和給藥組的脾細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和血細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析CD11b+ Gr1+MDSCs的含量變化。結(jié)果顯示：相比對(duì)照組,給藥組中脾組織和腫瘤組織的MDSCs細(xì)胞百分比明顯減少,表明在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中LCL521明顯降低MDSCs的含量。具有60-70mm3大小腫瘤的荷瘤小鼠在施加LCL521藥物作用7天(1次／天,共6次)后,給藥組腫瘤體積能有效得到抑制,表明LCL521對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)也起到有效得到抑制作用。3.J774和RAW兩種細(xì)胞可以分別作為MDSCs和巨噬細(xì)胞的體外模型。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析表明J774細(xì)胞絕大部分表現(xiàn)出CD11b、Gr1雙陽(yáng)性,而RAW主要是CD11b陽(yáng)性而Grl陰性。故我們采用J774作為CDllb+Grl+MDSCs的體外細(xì)胞模型,而RAW則作為巨噬細(xì)胞的體外模型,用于研究神經(jīng)酰胺類似物對(duì)腫瘤相關(guān)的免疫抑制細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制。4.神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521誘導(dǎo)J774、RAW細(xì)胞死亡排除了凋亡、程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞自噬的可能途徑。采用PI染色檢測(cè),結(jié)果顯示LCL521引起J774、RAW這兩種細(xì)胞濃度依賴性的死亡。為了進(jìn)一步探究LCL521誘導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞死亡的途徑,我們分別使用了Caspase的抑制劑、RIP1和RIP3的抑制劑、自噬的抑制劑,結(jié)果均未表現(xiàn)出對(duì)LCL521誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)作用。即LCL521誘導(dǎo)J774、RAW細(xì)胞死亡的途徑不是凋亡,不是程序性細(xì)胞死亡,也不是細(xì)胞自噬。5.神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521對(duì)J774、RAW細(xì)胞的作用靶點(diǎn)位于線粒體和溶酶體。經(jīng)過LCL521處理的J774、RAW細(xì)胞采用超高速密度梯度離心和線粒體分離方法,我們分別成功分離到了溶酶體和線粒體,將兩種細(xì)胞器的溶解產(chǎn)物分別經(jīng)過LC-MS/MS檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)大量LCL521定位于溶酶體和線粒體。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)鞘氨醇在溶酶體和線粒體上的含量均明顯降低。6.神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521造成線粒體上Ca2+的過載,引起細(xì)胞內(nèi)ROS的升高,最終導(dǎo)致J774和RAW細(xì)胞死亡。經(jīng)過LCL521處理的J774、RAW細(xì)胞采用Ca2+的指示劑Rhod-2-AM和Fluo-3-AM, ROS的指示劑DCFDA檢測(cè),發(fā)現(xiàn)線粒體和細(xì)胞液的Ca2+濃度都明顯升高,細(xì)胞內(nèi)的ROS濃度也有明顯的升高。為了進(jìn)一步探究Ca2+的來源及其是否與ROS的變化有直接關(guān)系,我們分別使用了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+通道抑制劑和細(xì)胞外Ca2+的螯合劑,發(fā)現(xiàn)J774細(xì)胞的Ca2+來源于細(xì)胞外,而RAW細(xì)胞的Ca2+來源于細(xì)胞內(nèi)。Ca2+被阻斷后,使得細(xì)胞內(nèi)ROS降低,最終引起細(xì)胞死亡的減少。7.神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521激活溶酶體上組織蛋白酶B和D的信號(hào)通路,引起J774和RAW細(xì)胞死亡。采用組織蛋白酶B和D的抑制劑CA-074me和PA分別單獨(dú)和聯(lián)合使用處理的J774和RAW細(xì)胞后,加入LCL521作用。我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用其中任何一種抑制劑后并沒有逆轉(zhuǎn)LCL521引起的J774和RAW細(xì)胞死亡,而這兩個(gè)抑制劑聯(lián)合使用時(shí),逆轉(zhuǎn)了LCL521誘導(dǎo)的J774和RAW細(xì)胞死亡。這表明了神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521誘導(dǎo)的J774和RAW細(xì)胞死亡基于組織蛋白酶B和D信號(hào)通路。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521能有效誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)的免疫抑制細(xì)胞的死亡,并闡明了神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521在腫瘤相關(guān)的免疫抑制細(xì)胞作用中的分子機(jī)制。首次揭示了LCL521可以作為一種腫瘤相關(guān)的免疫抑制細(xì)胞的抑制劑,揭示了神經(jīng)酰胺類似物作為腫瘤相關(guān)的免疫抑制細(xì)胞抑制劑的潛能,并為腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制的免疫治療提供了一條新的思路。
[Abstract]:Immunosuppressive cells , especially ceramides ( iDCs ) , tumor - related macrophages ( TAM ) , bone marrow - derived inhibitory cells ( MDSCs ) , regulatory T cells ( Treg ) , have been developed . The results showed that LCL521 induced the death of J774 and RAW cells . The results showed that LCL521 could induce apoptosis of J774 and RAW cells . The results showed that LCL521 could induce apoptosis of J774 and RAW cells . The molecular mechanism of ceramide analogues LCL521 in tumor - related immunosuppressive cells is illustrated . LCL521 can be used as an inhibitor of tumor - related immunosuppressive cells , and the potential of ceramide analogues as tumor - related immunosuppressive cell inhibitors is disclosed , and a new idea is provided for immunotherapy of tumor - induced immunosuppression .
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.51

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本文編號(hào)：2047122