本文選題：腫瘤內(nèi)異質(zhì)性 + 單細(xì)胞　； 參考：《浙江大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景目前腫瘤細(xì)胞耐藥仍是腫瘤治愈的主要障礙。近來,越來越多的研究證明腫瘤內(nèi)異質(zhì)性是腫瘤細(xì)胞耐藥的主要原因之一。單細(xì)胞基因測序技術(shù)證明了同一個腫瘤不同空間存在基因的多態(tài)性。腫瘤內(nèi)異質(zhì)性產(chǎn)生的原因通常包括:基因組的變化、隨機(jī)過程、微環(huán)境的改變以及細(xì)胞組織的可塑性。精準(zhǔn)醫(yī)療的提出是基于腫瘤的異質(zhì)性,主要是基于腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)的差異給予個體化治療或在患者的不同階段給予相應(yīng)的治療。然而,這種異質(zhì)性的基礎(chǔ)是真的異質(zhì)性,即基因組的差異引起的真的表型差異,然而基因表達(dá)的差異并不僅僅由于基因組的差異造成,由其他原因如表觀遺傳學(xué)或隨機(jī)性過程導(dǎo)致的基因表達(dá)差異,在精準(zhǔn)醫(yī)療下是否還能給患者帶來獲益,這是需要冷靜思考的問題。同一細(xì)胞系內(nèi)的腫瘤細(xì)胞亦可被認(rèn)為是由具有異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞所構(gòu)成。然而尚未有研究報道來自于同一細(xì)胞系或單個腫瘤細(xì)胞的克隆對于藥物的反應(yīng)性會存在多大差異。我們選擇細(xì)胞系為模型,探討在同一細(xì)胞系內(nèi)或單個腫瘤細(xì)胞的子代克隆的藥物反應(yīng)譜的多態(tài)性。研究方法我們分別研究了 4T1、Bcap37、K562三個細(xì)胞系。首先,利用極限稀釋法獲得單細(xì)胞克隆一代(4T1、Bcap37、K562),MTT方法測定多種化療藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50),實時熒光定量PCR方法檢測耐藥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)。然后,在上述一代克隆中挑選某一克隆再次利用極限稀釋法獲得單細(xì)胞二代子克隆,同樣測定其不同藥物的IC50以及相關(guān)基因mRNA表達(dá)。另外通過聚類分析的統(tǒng)計學(xué)方法檢驗上述一代及二代克隆在IC50和基因mRNA表達(dá)的異質(zhì)性是否具有統(tǒng)計學(xué)差異。值得注意的是,在4T1細(xì)胞系中,我們利用基質(zhì)膠3D培養(yǎng)的方法以及CD24/CD44免疫熒光分選出了具有干性特征的細(xì)胞。研究結(jié)果1.4T1細(xì)胞系單細(xì)胞克隆及二代子克隆的異質(zhì)性CD24+CD44+細(xì)胞并且3D培養(yǎng)能夠產(chǎn)生分化的腺管結(jié)構(gòu)的這群克隆S和CD24+CD44-并且不能培養(yǎng)出腺管結(jié)構(gòu)的這群克隆N,兩群克隆內(nèi)部均存在明顯的異質(zhì)性。11個單細(xì)胞克隆S或N在11個傳統(tǒng)化療藥物的反應(yīng)譜均存在明顯的差異,表現(xiàn)在:對于某一個藥物,11個克隆間的IC50有顯著差別;對于某一個克隆,在11種藥物表現(xiàn)出不同的反應(yīng)譜。同樣,19個耐藥相關(guān)基因mRNA的表達(dá)的差異性亦存在。而且,利用相同培養(yǎng)條件,未予藥物刺激,獲得的單細(xì)胞克隆S1或N2的二代子克隆仍表現(xiàn)出藥物反應(yīng)譜及基因表達(dá)譜的明顯差異,與一代克隆表現(xiàn)一致。此外,分別以藥物IC50和基因表達(dá)作為變量對上述克隆(一代克隆或二代子克隆)進(jìn)行聚類分析統(tǒng)計,均出現(xiàn)多個分類。2.Bcap37細(xì)胞系單細(xì)胞克隆及二代子克隆的異質(zhì)性源自于Bcap37細(xì)胞系的一代以及二代單細(xì)胞克隆在9種傳統(tǒng)化療藥物的反應(yīng)譜存在多態(tài)性。但是差異性不及4T1細(xì)胞系的克隆那么大,最大差異倍數(shù)僅為8倍,而4T1細(xì)胞系的S組克隆間的最大差異倍數(shù)為273倍。而且,源自于Bcap37細(xì)胞系克隆的藥物IC50絕對值比4T1細(xì)胞系克隆的IC50值大,這也指出不同細(xì)胞系之間的個體差異。同樣,一代及二代克隆的耐藥相關(guān)基因mRNA表達(dá)亦存在明顯差異性。聚類分析同樣驗證了上述克隆或子克隆存在多個類別。3.K562細(xì)胞系單細(xì)胞克隆及二代子克隆的異質(zhì)性靶向藥物伊馬替尼在一代單細(xì)胞克隆間的IC50存在差異性,而在二代子克隆間無明顯差異。而對于傳統(tǒng)化療藥物,在一代及二代單細(xì)胞克隆間的藥物反應(yīng)譜均有明顯異質(zhì)性。BCR/ABL融合基因及其他耐藥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)無論在一代或二代克隆間亦表現(xiàn)出明顯差異。c-Abl蛋白的表達(dá)在一代及二代克隆間亦存在顯著差異。此外,在分別以傳統(tǒng)化療藥物IC50和相關(guān)基因表達(dá)作為變量對上述克隆(一代克隆或二代子克隆)進(jìn)行聚類分析,均出現(xiàn)了多個分類。且通過單因素方差分析也驗證了 c-Abl蛋白的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論結(jié)果表明,單個腫瘤細(xì)胞能夠重新繁衍出一群基因組背景相同,然而藥物反應(yīng)譜顯著不同的子代單細(xì)胞克隆,并且這類藥物反應(yīng)多態(tài)性的獲得不需要藥物的預(yù)刺激,是完全隨機(jī)的。該結(jié)果首次提出了由單個細(xì)胞衍化而來的穩(wěn)定增殖的子代克隆間存在藥物反應(yīng)異質(zhì)性。
[Abstract]:Single cell clone generation ( 4T1 , Bcap37 , K562 ) was used to determine the gene expression in tumor cells . The expression of BCR / ABL fusion gene and other drug resistant related gene transcriptome was significantly different between generation and second generation . The results showed that the expression of c - Abl protein was similar to one generation or two generations .
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5

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本文編號：2021926