本文關(guān)鍵詞：虎杖苷抗腫瘤作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《蘇州大學》 2013年

虎杖苷抗腫瘤作用及機制研究

張玉松  

【摘要】：惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康和生命的疾病，由于人口增長、老齡化和不良生活習慣的影響，近年來在全世界范圍內(nèi)惡性腫瘤的發(fā)病率持續(xù)上升。惡性腫瘤已成為發(fā)達國家和發(fā)展中國家的首位死因。乳腺癌是世界各地女性最常見的惡性腫瘤之一，，占女性新發(fā)惡性腫瘤的23%，具有發(fā)病率高、侵襲性強、病程進展緩慢等特點。肺癌則是男性中最常見的惡性腫瘤，是男性癌性死亡的首位原因，女性癌性死亡的第二大腫瘤。 目前對于惡性腫瘤的主要治療方法包括：手術(shù)，放射治療，化療和分子靶向治療�；熢趷盒阅[瘤治療中仍處于基礎(chǔ)地位，但目前臨床上廣泛使用的化療藥物療效有限，毒性作用較大，經(jīng)幾次應用后還會發(fā)生耐藥。近年來，采用傳統(tǒng)中藥等植物提取物探討惡性腫瘤治療的新途徑引起了人們的關(guān)注，從傳統(tǒng)中藥提取的抗腫瘤藥物如冬凌草甲素、黃連素、姜黃素的體外實驗表明可抑制多種腫瘤細胞的增殖，從植物中提取的紫杉醇、喜樹堿、長春新堿等藥物已在臨床上廣泛應用。因此篩選新型抗腫瘤的植物藥，確定其抗腫瘤作用并探討其機制，已成為當今腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點之一。 虎杖苷是從虎杖的干燥根莖中提取的第4種單體，又名白藜蘆醇苷，現(xiàn)代藥理學研究表明虎杖苷對心肌細胞、血管平滑肌細胞、抗血小板聚集、改善微循環(huán)等有顯著作用，此外還能減輕多種因素造成的組織器官損傷，具有保護肝細胞，降血脂及抗脂質(zhì)過氧化等作用。而對其抗腫瘤作用的研究報道仍較少，本課題是研究虎杖苷在乳腺癌細胞、肺癌中的生物學功能以及相關(guān)機制，旨為進一步開展虎杖苷抗腫瘤作用的基礎(chǔ)和臨床研究提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本課題實驗內(nèi)容主要分為五部分： 第一部分虎杖苷對惡性腫瘤增殖抑制效應的研究 目的： 研究虎杖苷在體內(nèi)外對乳腺癌、肺癌生長的影響，并觀察其對正常細胞的毒性和在體內(nèi)的對實驗動物的毒副作用。 方法： 應用MTT或CCK8法檢測虎杖苷對10種不同來源的惡性腫瘤細胞及兩種正常上皮細胞生存曲線的影響并比較了虎杖苷和白藜蘆醇抑制腫瘤細胞生長的效力。應用流式細胞術(shù)分析虎杖苷對乳腺癌及肺癌細胞的細胞周期變化的影響及凋亡誘導情況。采用人肺癌細胞皮下移植動物模型觀察虎杖苷對動物體內(nèi)腫瘤生長的影響及其毒副作用。 結(jié)果： 虎杖苷對10種不同來源的惡性腫瘤細胞包括乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231，肺癌A549、NCI-H1975、宮頸癌Hela、卵巢癌SKOV-3、肝癌SM7721、鼻咽癌CNE-1，白血病HL-60及K562細胞均具有明顯的抑制其生長的作用，且生長抑制作用呈劑量和時間-效應關(guān)系�；⒄溶諏φＨ橄偕掀ぜ毎鸐CF-10A及肺支氣管上皮細胞HBE的毒性作用小于相應的腫瘤細胞�；⒄溶諏θ橄侔┘胺伟┘毎纳L抑制作用明顯強于其糖配基白藜蘆醇。流式細胞術(shù)的結(jié)果顯示虎杖苷可引起腫瘤細胞阻滯于細胞周期進程的S期，虎杖苷誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。動物實驗結(jié)果顯示虎杖苷可明顯抑制裸鼠移植瘤的生長且未見明顯毒副反應。 第二部分虎杖苷抗腫瘤作用的分子機制研究 目的： 研究虎杖苷抑制腫瘤細胞生長、引起細胞周期阻滯及誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制。 方法： 采用人磷酸化激酶蛋白芯片及凋亡相關(guān)蛋白芯片檢測經(jīng)虎杖苷處理的乳腺癌細胞內(nèi)磷酸化激酶及凋亡相關(guān)蛋白的變化。應用Western blot實驗驗證和檢測與細胞生長、細胞周期進程和細胞凋亡相關(guān)蛋白的變化。應用MTT法及流式細胞術(shù)檢測PI3K、Erk、JNK、P38抑制劑對虎杖苷抗腫瘤作用的影響。 結(jié)果： 虎杖苷處理后的乳腺癌細胞內(nèi)CREB的活性受到抑制，且抑制作用在虎杖苷作用后2小時即發(fā)生并一直持續(xù)至40小時。細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1的表達在虎杖苷處理后的乳腺癌及肺癌細胞表達明顯下降。虎杖苷處理后的乳腺癌細胞內(nèi)源性和外源性凋亡途徑均被激活。PI3K、Erk、JNK、P38抑制劑對虎杖苷抑制腫瘤細胞生長、引起細胞周期阻滯及誘導腫瘤細胞凋亡的作用無明顯影響。 第三部分虎杖苷對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的影響及分子機制研究 目的： 研究虎杖苷對如乳腺癌及肺癌細胞轉(zhuǎn)移及侵襲的影響，并對其分子機制進行初步探討。 方法： 應用傷口愈合實驗及Transwell細胞遷移實驗觀察虎杖苷對細胞遷移能力的影響。應用腫瘤細胞粘壁實驗觀察虎杖苷對腫瘤細胞粘附能力的影響。采用Transwell細胞侵襲實驗觀察虎杖苷對腫瘤細胞侵襲能力的影響。采用Western blot實驗檢測與細胞轉(zhuǎn)移浸潤相關(guān)蛋白表達的變化。 結(jié)果： 傷口愈合實驗及Transwell細胞遷移實驗顯示虎杖苷可抑制乳腺癌及肺癌細胞的遷移，粘壁實驗結(jié)果顯示虎杖苷可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的粘附能力，Transwell細胞侵襲實驗結(jié)果顯示虎杖苷可明顯抑制乳腺癌細胞的侵襲能力。Western blot的實驗結(jié)果顯示經(jīng)虎杖苷處理后的乳腺癌細胞E-cadherin、-catenin的表達上調(diào)，N-cadherin的表達下調(diào)，MMP-2、MMP-9的表達無明顯變化。 第四部分虎杖苷對阿霉素耐藥乳腺癌細胞的生長抑制作用研究 目的： 研究虎杖苷對乳腺癌耐阿霉素細胞MCF-7/ADR增殖、細胞周期及凋亡的影響，并初步探討其分子機制。 方法： 應用MTT法檢測虎杖苷對乳腺癌耐阿霉素細胞MCF-7/ADR的生存曲線的影響，應用流式細胞術(shù)檢測虎杖苷處理MCF-7/ADR細胞后細胞周期的變化和凋亡發(fā)生率，應用Western blot實驗檢測虎杖苷對MCF-7/ADR細胞的細胞周期、凋亡相關(guān)蛋白的影響。 結(jié)果： MCF-7/ADR細胞除了對阿霉素耐藥外還對吉西他濱和紫杉醇耐受，虎杖苷可抑制MCF-7/ADR的生長且其抑制作用與MCF-7細胞相比無明顯差異。流式細胞術(shù)的結(jié)果顯示虎杖苷引起MCF-7/ADR細胞發(fā)生細胞周期G0/G1期阻滯，虎杖苷誘導MCF-7/ADR細胞發(fā)生凋亡，且凋亡誘導效應呈劑量依賴。Western blot實驗顯示虎杖苷處理的MCF-7/ADR細胞Bcl-2、CyclinD1及NF-B表達下降、Bax及Cleaved-PARP表達上調(diào)。 第五部分虎杖苷對晚期炎癥因子HMGB1影響的研究 目的： 研究虎杖苷對LPS刺激巨噬細胞后晚期炎癥因子HMGB1及多種早期炎癥因子釋放的影響。 方法： 應用Western blot實驗檢測虎杖苷及白藜蘆醇對LPS刺激巨噬細胞產(chǎn)生的HMGB1的影響，應用Griess法檢測虎杖苷對LPS刺激巨噬細胞產(chǎn)生的NO的影響，應用細胞因子芯片檢測虎杖苷及白藜蘆醇對LPS刺激巨噬細胞產(chǎn)生的多種早期炎癥因子的影響。 結(jié)果： LPS刺激巨噬細胞后，細胞釋放大量HMGB1，虎杖苷在0.06和0.12mol/L的劑量范圍內(nèi)則可減少LPS所引起的HMGB1的釋放,白藜蘆醇在0.5-2.5mol/L的劑量范圍內(nèi)可抑制LPS誘導的HMGB1的釋放�；⒄溶諏PS所引起的NO的釋放無明顯影響。細胞因子芯片的結(jié)果顯示，虎杖苷及白藜蘆醇在可抑制HMGB釋放的濃度范圍內(nèi)對62種早期炎癥因子無明顯影響。 結(jié)論 (1)虎杖苷具有廣譜的抑制腫瘤細胞增殖的作用，且虎杖苷在抑制腫瘤細胞生長的同時對正常細胞的毒性較小，在動物體內(nèi)實驗，虎杖苷可抑制裸鼠移植瘤的生長并對動物無明顯毒副作用�；⒄溶胀ㄟ^導致細胞周期S期阻滯及誘導凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。虎杖苷抑制腫瘤細胞生長、引起細胞周期阻滯及誘導腫瘤細胞凋亡的機制可能與抑制CREB的活性，下調(diào)Cyclin D1，激活內(nèi)外源性細胞凋亡信號通路有關(guān)�；⒄溶湛鼓[瘤作用與PI3K/AKT及MAPK信號通路及NF-B無關(guān)。 (2)在不明顯影響細胞生長的濃度下，虎杖苷在體外可抑制乳腺癌和肺癌細胞的貼壁能力、遷移和侵襲能力，其抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移能力的機制可能與上調(diào)E-cadherin、-catenin蛋白，下調(diào)N-cadherin蛋白的表達有關(guān)。 (3)虎杖苷對乳腺癌耐阿霉素細胞仍具有增殖抑制作用，導致乳腺癌耐阿霉素MCF-7/ADR細胞細胞周期G0/G1期阻滯及發(fā)生凋亡，其機制可能上調(diào)Bax蛋白、激活PARP，下調(diào)Bcl-2及NF-B蛋白的表達有關(guān)。 (4)虎杖苷對LPS誘導巨噬細胞后晚期炎癥因子HMGB1及多種早期炎癥因子的產(chǎn)生無明顯影響。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R285
【目錄】：

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本文編號：200672