本文選題：噬菌體展示 + 人重鏈單域抗體　； 參考：《暨南大學》2016年博士論文

【摘要】：腫瘤在體內生長和轉移均離不開血管,而血管內皮生長因子(VEGF)在血管發(fā)生和生成中起到關鍵的調節(jié)作用,目前已有抗VEGF的上市抗體Bevacizumab和Aflibercept用于治療多種癌癥,這說明VEGF是一個很好的用于治療癌癥的靶標。多種癌細胞能夠過表達表皮生長因子受體(EGFR),EGFR的異常激活可以幫助癌細胞存活、增殖、入侵和轉移,目前已經(jīng)有多個抗EGFR的單克隆抗體及其抑制劑上市用于治療多種癌癥,因此EGFR也是一個很好的用于治療癌癥的靶標。雖然這些上市的抗體對于多種癌癥具有一定的治療效果,但這些抗體都是常規(guī)的單克隆抗體,這些抗體具有的分子量大,組織滲透性低,不方便進行基因工程改造,必須在真核細胞內表達等缺點。此論文的目的是想得到更好的新的抗體,經(jīng)過逐步的抗體改造和完善,希望這些新的抗體能夠代替這些上市的抗體。人重鏈單域抗體(human VH domain antibody,hd Ab)無免疫源性,分子量小,組織滲透性強,方便進行基因工程改造,具有很好的應用前景,本課題的目的是通過噬菌體展示技術分別篩選抗VEGF和EGFR的hd Ab,并對其進行初步分析,為進一步抗體改造及其用于癌癥治療打下一定的基礎。此論文的第一部分是篩選和分析抗VEGF的hd Ab:(1)選擇VEGF外顯子3-4片段作為抗原,將其DNA克隆至表達載體,利用大腸桿菌表達,并成功地對VEGF包涵體進行蛋白純化和復性;(2)采用噬菌體展示技術從hd Ab噬菌體文庫中篩選抗VEGF的hd Ab噬菌體,經(jīng)過5輪篩選,特異性結合VEGF的hd Ab噬菌體得到富集;(3)從第5輪篩選后的噬菌體中隨機挑選370個噬菌體克隆,采用單克隆噬菌體ELISA檢測得到41個陽性克隆;經(jīng)過無關抗原的ELISA驗證,得到17個特異性較高的噬菌體克隆;(4)對這17個陽性hd Ab的DNA序列測序比對,排除同樣的克隆,得到4個陽性噬菌體克隆;(5)將這4個hd Ab的DNA序列進行PCR擴增,并克隆至表達載體中,在大腸桿菌中進行可溶性表達和純化;(6)采用ELISA分別鑒定4個hdAb與VEGF之間的結合,結果發(fā)現(xiàn)其中有2個hd Ab與VEGF不能結合,有2個hd Ab能與VEGF結合,其中有1個hd Ab(aVE207)結合力較高;采用Western blotting進一步證實aVE207能與VEGF結合;(7)采用非競爭性ELISA檢測aVE207與VEGF之間的親和力KD值為61 nM。此論文的第二部分是篩選和分析抗EGFR的hd Ab:(1)選擇EGFR domain III的氨基酸408 437片段作為抗原,并對該多肽片段進行人工合成,合成的多肽經(jīng)液相色譜及質譜分析確認具有適當?shù)募兌燃按笮?(2)采用噬菌體展示技術從hdAb噬菌體文庫中篩選抗EGFR多肽的hd Ab噬菌體,經(jīng)過5輪篩選,特異性結合EGFR多肽的hd Ab噬菌體得到富集;(3)從第5輪篩選后的噬菌體中隨機挑選470個噬菌體克隆,采用單克隆噬菌體ELISA檢測得到24個陽性克隆;經(jīng)過無關抗原的ELISA驗證,得到13個特異性較高的噬菌體克隆;(4)對這13陽性hd Ab的DNA序列測序比對,排除相同的克隆,得到5個陽性噬菌體克隆;(5)將這5個hd Ab的DNA序列進行PCR擴增,并克隆至表達載體中,在大腸桿菌中進行可溶性表達和純化;(6)采用ELISA分別鑒定5個hd Ab與EGFR多肽之間的結合,結果發(fā)現(xiàn)5個hd Ab均能與EGFR多肽結合,其中有2個hd Ab(aEG3C6、aEG4C6)結合力較高,aEG3C6和aEG4C6親和力KD值分別為62 nM和102 nM。綜上所述,通過噬菌體展示技術,成功地從hd Ab噬菌體文庫中篩選得到了4個抗VEGF的hd Ab噬菌體,并成功表達和純化這4個hdAb,鑒定發(fā)現(xiàn)其中有1個hd Ab(aVE207)與VEGF具有較強的結合,親和力KD值大小為61 nM。另外,還成功地從hd Ab噬菌體文庫中篩選得到了5個抗EGFR的hdAb噬菌體,并成功表達和純化這5個hd Ab,鑒定發(fā)現(xiàn)其中有2個hd Ab(aEG3C6、aEG4C6)與EGFR具有較強的結合,親和力KD值大小分別為62 nM和102 nM。
[Abstract]:Human VH domain antibody ( hd Ab ) has been used to treat multiple cancers . 鎺掗櫎鍚屾牱鐨勫厠闅，

本文編號：1999547