本文選題：噬菌體展示 + 人重鏈單域抗體�。� 參考：《暨南大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移均離不開血管,而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在血管發(fā)生和生成中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,目前已有抗VEGF的上市抗體Bevacizumab和Aflibercept用于治療多種癌癥,這說明VEGF是一個(gè)很好的用于治療癌癥的靶標(biāo)。多種癌細(xì)胞能夠過表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR),EGFR的異常激活可以幫助癌細(xì)胞存活、增殖、入侵和轉(zhuǎn)移,目前已經(jīng)有多個(gè)抗EGFR的單克隆抗體及其抑制劑上市用于治療多種癌癥,因此EGFR也是一個(gè)很好的用于治療癌癥的靶標(biāo)。雖然這些上市的抗體對(duì)于多種癌癥具有一定的治療效果,但這些抗體都是常規(guī)的單克隆抗體,這些抗體具有的分子量大,組織滲透性低,不方便進(jìn)行基因工程改造,必須在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)等缺點(diǎn)。此論文的目的是想得到更好的新的抗體,經(jīng)過逐步的抗體改造和完善,希望這些新的抗體能夠代替這些上市的抗體。人重鏈單域抗體(human VH domain antibody,hd Ab)無免疫源性,分子量小,組織滲透性強(qiáng),方便進(jìn)行基因工程改造,具有很好的應(yīng)用前景,本課題的目的是通過噬菌體展示技術(shù)分別篩選抗VEGF和EGFR的hd Ab,并對(duì)其進(jìn)行初步分析,為進(jìn)一步抗體改造及其用于癌癥治療打下一定的基礎(chǔ)。此論文的第一部分是篩選和分析抗VEGF的hd Ab:(1)選擇VEGF外顯子3-4片段作為抗原,將其DNA克隆至表達(dá)載體,利用大腸桿菌表達(dá),并成功地對(duì)VEGF包涵體進(jìn)行蛋白純化和復(fù)性;(2)采用噬菌體展示技術(shù)從hd Ab噬菌體文庫中篩選抗VEGF的hd Ab噬菌體,經(jīng)過5輪篩選,特異性結(jié)合VEGF的hd Ab噬菌體得到富集;(3)從第5輪篩選后的噬菌體中隨機(jī)挑選370個(gè)噬菌體克隆,采用單克隆噬菌體ELISA檢測(cè)得到41個(gè)陽性克隆;經(jīng)過無關(guān)抗原的ELISA驗(yàn)證,得到17個(gè)特異性較高的噬菌體克隆;(4)對(duì)這17個(gè)陽性hd Ab的DNA序列測(cè)序比對(duì),排除同樣的克隆,得到4個(gè)陽性噬菌體克隆;(5)將這4個(gè)hd Ab的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并克隆至表達(dá)載體中,在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)和純化;(6)采用ELISA分別鑒定4個(gè)hdAb與VEGF之間的結(jié)合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有2個(gè)hd Ab與VEGF不能結(jié)合,有2個(gè)hd Ab能與VEGF結(jié)合,其中有1個(gè)hd Ab(aVE207)結(jié)合力較高;采用Western blotting進(jìn)一步證實(shí)aVE207能與VEGF結(jié)合;(7)采用非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)aVE207與VEGF之間的親和力KD值為61 nM。此論文的第二部分是篩選和分析抗EGFR的hd Ab:(1)選擇EGFR domain III的氨基酸408 437片段作為抗原,并對(duì)該多肽片段進(jìn)行人工合成,合成的多肽經(jīng)液相色譜及質(zhì)譜分析確認(rèn)具有適當(dāng)?shù)募兌燃按笮?(2)采用噬菌體展示技術(shù)從hdAb噬菌體文庫中篩選抗EGFR多肽的hd Ab噬菌體,經(jīng)過5輪篩選,特異性結(jié)合EGFR多肽的hd Ab噬菌體得到富集;(3)從第5輪篩選后的噬菌體中隨機(jī)挑選470個(gè)噬菌體克隆,采用單克隆噬菌體ELISA檢測(cè)得到24個(gè)陽性克隆;經(jīng)過無關(guān)抗原的ELISA驗(yàn)證,得到13個(gè)特異性較高的噬菌體克隆;(4)對(duì)這13陽性hd Ab的DNA序列測(cè)序比對(duì),排除相同的克隆,得到5個(gè)陽性噬菌體克隆;(5)將這5個(gè)hd Ab的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并克隆至表達(dá)載體中,在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)和純化;(6)采用ELISA分別鑒定5個(gè)hd Ab與EGFR多肽之間的結(jié)合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)hd Ab均能與EGFR多肽結(jié)合,其中有2個(gè)hd Ab(aEG3C6、aEG4C6)結(jié)合力較高,aEG3C6和aEG4C6親和力KD值分別為62 nM和102 nM。綜上所述,通過噬菌體展示技術(shù),成功地從hd Ab噬菌體文庫中篩選得到了4個(gè)抗VEGF的hd Ab噬菌體,并成功表達(dá)和純化這4個(gè)hdAb,鑒定發(fā)現(xiàn)其中有1個(gè)hd Ab(aVE207)與VEGF具有較強(qiáng)的結(jié)合,親和力KD值大小為61 nM。另外,還成功地從hd Ab噬菌體文庫中篩選得到了5個(gè)抗EGFR的hdAb噬菌體,并成功表達(dá)和純化這5個(gè)hd Ab,鑒定發(fā)現(xiàn)其中有2個(gè)hd Ab(aEG3C6、aEG4C6)與EGFR具有較強(qiáng)的結(jié)合,親和力KD值大小分別為62 nM和102 nM。
[Abstract]:Human VH domain antibody ( hd Ab ) has been used to treat multiple cancers . 鎺掗櫎鍚屾牱鐨勫厠闅，

本文編號(hào)：1999547