本文選題：NS + HL-60細(xì)胞　； 參考：《鄭州大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的:通過回顧本課題組前期研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)下調(diào)p53缺失型白血病HL-60細(xì)胞核干細(xì)胞因子(Nucleostemin,NS)后,該細(xì)胞p38MAPK基因發(fā)生明顯上調(diào),本研究主要對(duì)p38MAPK通路中的相關(guān)蛋白的表達(dá)改變進(jìn)行檢測(cè),分析NS與p38MAPK通路之間的相關(guān)性,初步探索NS下調(diào)后所導(dǎo)致該通路變化的可能原因,為進(jìn)一步探索NS非依賴性p53信號(hào)通路的具體機(jī)制提供理論依據(jù)。方法:(1)本課題組前期已經(jīng)構(gòu)建好針對(duì)NS基因的重組慢病毒載體(NS-RNAi-GV248)和陰性空載體,直接從公司病毒庫購買。(2)根據(jù)HL-60細(xì)胞的合適的MOI值及病毒滴度,將NS-RNAi-GV248慢病毒載體轉(zhuǎn)染至人白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞內(nèi)以下調(diào)其NS的表達(dá),通過倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的效率,采用Western Blot技術(shù)測(cè)定HL-60細(xì)胞內(nèi)NS蛋白的下調(diào)情況。(3)采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)慢病毒感染后空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞中p38MAPK通路中的相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,即p-p38MAPK/p38MAPK兩個(gè)比值的變化。(4)采用Image J圖像處理軟件對(duì)目的蛋白條帶的灰度進(jìn)行比對(duì)分析并計(jì)算。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理分析,所有的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組獨(dú)立的樣本之間的比較采用單因素方差分析,而進(jìn)一步兩兩樣本之間的比較則采用Bonferroni法,校正檢驗(yàn)水平α’=0.0167,P0.05表示數(shù)據(jù)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:(1)根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果,NS-RNAi-GV248慢病毒載體感染人白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞的最適MOI值為80。以MOI=80的條件感染HL-60細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡觀察顯示慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%以上;Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:慢病毒轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組中HL-60細(xì)胞的NS蛋白表達(dá)量出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。(2)Western Blot技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示慢病毒轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組中HL-60細(xì)胞p-p38/p38的比值(0.444±0.008)高于陰性對(duì)照組(0.286±0.016)和空白對(duì)照組(0.261±0.019)(P0.05),表示NS表達(dá)下調(diào)后p38MAPK通路中的p-p38MAPK蛋白表達(dá)量增加。結(jié)論:(1)HL-60細(xì)胞內(nèi)p38MAPK通路中的p-p38蛋白的表達(dá)與NS表達(dá)下調(diào)呈負(fù)相關(guān)。(2)NS非依賴性p53的作用過程可能與激活p38MAPK通路有關(guān),p38MAPK通路可能是NS的p53非依賴性通路之一。
[Abstract]:Objective: by reviewing our previous study results, we found that p38 MAPK gene was up-regulated after down-regulation of p53 deletion leukemia HL-60 nuclear stem cell factor Nucleosteminin NSN. In this study, the expression of related proteins in p38 MAPK pathway was detected, the correlation between NS and p38 MAPK pathway was analyzed, and the possible causes of the changes in p38 MAPK pathway after downregulation of NS were preliminarily explored. It provides theoretical basis for further exploring the specific mechanism of NS independent p53 signaling pathway. Methods: 1) the recombinant lentivirus vector NS-RNAi-GV248 for NS gene and the negative empty vector were constructed by our research group and purchased directly from the virus library of the company.) according to the appropriate moi value and virus titer of HL-60 cells, the recombinant vector NS-RNAi-GV248 and the negative empty vector were constructed by our research group. NS-RNAi-GV248 lentivirus vector was transfected into human leukemia cell line HL-60 to down-regulate the expression of NS, and the transfection efficiency was observed by inverted fluorescence microscope. The down-regulation of NS protein in HL-60 cells was detected by Western Blot. The expression of p38MAPK in HL-60 cells was detected by Western Blot. That is, the change of p-p38 MAPK / p38 MAPK ratio. (4) Image J image processing software is used to analyze and calculate the gray scale of the target protein band. SPSS 17.0 statistical software was used to process and analyze the data results. All the data were expressed as mean 鹵standard deviation x 鹵s. The comparison between multiple independent samples was based on single factor analysis of variance, and Bonferroni method was used for further comparison between two and two samples. The calibration test level (偽) 0.0167 (P 0.05) indicated that the difference between the data was statistically significant. Results the optimal Moi of HL-60 cells infected with NS-RNAi-GV248 lentivirus vector was 80. HL-60 cells were infected with MOIN80. Inverted fluorescence microscope observation showed that the efficiency of lentivirus vector transfection reached more than 80%. The results showed that the expression of NS protein in HL-60 cells after lentivirus transfection was significantly down-regulated by Western blot. The ratio of p-p38/p38 in HL-60 cells after lentivirus transfection was 0.444 鹵0.008), which was higher than that in negative control group (0.286 鹵0.016) and blank control group (0.261 鹵0.019), indicating that the expression of p-p38 MAPK protein in p38 MAPK pathway increased after down-regulation of NS expression. Conclusion the expression of p-p38 protein in p38 MAPK pathway in HL-60 cells is negatively correlated with the down-regulation of NS expression. NS-independent p53 may be involved in the activation of p38 MAPK pathway, which may be one of the p53 independent pathways in NS.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.7

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9 張U，

本文編號(hào)：1999759