本文選題：多發(fā)性骨髓瘤 + 循環(huán)微小RNA�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一個(gè)復(fù)雜的惡性血液系統(tǒng)疾病,其特征是骨髓中漿細(xì)胞異�？寺⌒栽鲋�,并大量的分泌單克隆免疫球蛋白及其片段,以致多數(shù)MM患者有不同程度的骨骼、腎臟等組織器官的損傷。MM發(fā)病率僅次于非霍奇金淋巴瘤,約占所有血液腫瘤的13%。MM主要好發(fā)于老年人,年齡大多在50-75歲之間,男女比例3:2。國(guó)際骨髓瘤工作組對(duì)多發(fā)性骨髓瘤制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)為:骨髓中克隆性漿細(xì)胞的比例≥10%和(或)活組織檢查證實(shí)存在有漿細(xì)胞瘤,血液和尿液中有單克隆免疫球蛋白,另外有貧血、高鈣血癥、骨質(zhì)破壞、腎功能損害以及免疫缺陷等的骨髓瘤相關(guān)的終末器官和組織損傷。多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,主要涉及到骨髓微環(huán)境、遺傳學(xué)上的基因突變、DNA甲基化和組蛋白修飾等調(diào)控方式。在臨床治療中,盡管免疫調(diào)節(jié)因子(來(lái)那度胺、泊馬度胺)或蛋白酶體抑制劑(硼替佐米、卡非佐米)等新興療法顯著提高了患者的治療反應(yīng)率和總體生存率,但MM仍然不可治愈。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的研究表明,非編碼RNA,特別是微小RNA(micro RNA,miRNA)在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病過(guò)程中起著尤為重要的作用。miRNA是一類短的內(nèi)源性單鏈非編碼調(diào)控RNA分子,約有18~25個(gè)核苷酸大小,通過(guò)結(jié)合特定信使RNAs的3’端非編碼區(qū)(3'-untranslated region,3'-UTR)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),miRNA分子在多種不同的腫瘤類型中均發(fā)現(xiàn)有異常表達(dá),這些miRNA分子作為腫瘤抑制或促進(jìn)因子調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、細(xì)胞周期以及分化等方面。循環(huán)miRNA分子具有作為新型生物標(biāo)志物的潛力。在實(shí)體腫瘤中,例如乳腺癌患者的循環(huán)血漿miR-195表達(dá)增高,而且miR-195的異常表達(dá)有別于其他癌癥患者和健康人群。另外,與健康對(duì)照人群相比,循環(huán)血漿miR-195和let-7a在乳腺癌術(shù)后患者中的表達(dá)水平顯著下降。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中,急性淋巴細(xì)胞白血病患者的循環(huán)血清miR-128明顯高表達(dá),但在急性髓系白血病和正常對(duì)照組之間表達(dá)無(wú)明顯差異;循環(huán)血清let-7b和miRNA-233在AML和ALL患者表達(dá)均高于對(duì)照組;表明循環(huán)血清miR-128、let-7b和miRNA-233對(duì)白血病的診斷和分型有一定的參考價(jià)值。基于以上介紹,我們提出以下疑問(wèn):循環(huán)miRNA分子在MM患者外周血清中是否也有異常表達(dá)?異常表達(dá)的循環(huán)miRNA與MM的診斷及預(yù)后有無(wú)關(guān)聯(lián)呢?它們?cè)贛M的發(fā)病機(jī)制中又起著怎樣的作用?為了解決這些問(wèn)題,本課題運(yùn)用基因芯片、熒光定量PCR、大量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、流式細(xì)胞學(xué)等技術(shù)進(jìn)行了以下三部分的研究:1)多發(fā)性骨髓瘤血清中異常表達(dá)的miRNA分子的篩選與鑒定;2)所篩選出來(lái)的循環(huán)miRNA分子:miRNA-192-5p在不同疾病階段的多發(fā)性骨髓瘤血清中的表達(dá)水平及其與臨床參數(shù)的相關(guān)性分析;3)miRNA-192-5p在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。第一部分:多發(fā)性骨髓瘤血清中異常表達(dá)的miRNA分子有研究發(fā)現(xiàn),一些特定的異常表達(dá)的miRNA分子在大部分腫瘤患者的外周血清中均可檢出,并且稱這些miRNA分子為循環(huán)miRNA分子。循環(huán)miRNA不僅具有顯著的腫瘤相關(guān)性和組織特異性,還具有良好的穩(wěn)定性。另外,循環(huán)miRNA分子的檢測(cè)還具有創(chuàng)傷小、獲取簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。因此,循環(huán)miRNA分子有望成為腫瘤診斷中非侵入性的新型生物標(biāo)志物。本部分實(shí)驗(yàn)研究的主要目的是篩選出MM患者外周血清中異常表達(dá)的miRNA分子。首先,我們隨機(jī)選取初發(fā)MM患者及健康對(duì)照者各3例,利用特異性較高的Taq Man micro RNA表達(dá)譜芯片來(lái)篩選血清中異常表達(dá)的miRNA分子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6個(gè)低表達(dá)的miRNA分子,25個(gè)高表達(dá)的miRNA分子,其中miRNA-192-5p是在MM患者血清中的表達(dá)下調(diào)尤為明顯的miRNA分子。接下來(lái),選取20例初發(fā)MM患者和20例健康體檢者的血清樣本,對(duì)該芯片的篩選結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)miRNA-192-5p在MM患者血清中的表達(dá)水平顯著低于正常健康者(p0.01)。與此同時(shí),再利用定量PCR技術(shù),對(duì)MM細(xì)胞株LP-1細(xì)胞、正常人骨髓CD138+漿細(xì)胞中miRNA-192-5p的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與MM患者類似,miR-192-5p在MM細(xì)胞株LP-1中的表達(dá)水平也明顯低于其在正常人骨髓CD138+漿細(xì)胞的表達(dá)水平。第二部分:多發(fā)性骨髓瘤血清中miRNA-192-5p的表達(dá)量及其與MM臨床參數(shù)的相關(guān)性分析已經(jīng)有研究表明,循環(huán)血清中異常表達(dá)的miRNA分子與MM患者的危險(xiǎn)分層和生存期相關(guān)。比如,循環(huán)miRNA-15a、miRNA-16-1和miRNA-17-92的表達(dá)已經(jīng)被證明與MM患者的預(yù)后相關(guān)。循環(huán)miR-15a的表達(dá)水平在MM的ISS分期為II和III期的患者中比I期患者顯著減少;相反,血清miR-181a和miR-181b的表達(dá)水平在ISS II和III期患者中明顯增;而在總體生存期較短的患者中miR-866-5p、miR-17和miR-18a的表達(dá)較高,因此,可以根據(jù)它們的表達(dá)水平對(duì)MM患者的預(yù)后進(jìn)行分層,以提高基于ISS和熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,FISH)對(duì)MM危險(xiǎn)分層的敏感性。本部分實(shí)驗(yàn)主要探討不同疾病階段的MM患者外周血清中miRNA-192-5p的表達(dá)水平、以及miRNA-192-5p與相關(guān)臨床參數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析,目的是評(píng)估m(xù)iRNA-192-5p的異常表達(dá)在MM的診斷和疾病進(jìn)展、預(yù)后判斷中的應(yīng)用價(jià)值。首先,選取50例初發(fā)MM患者、15例完全緩解患者、15例臨床復(fù)發(fā)患者以及80例健康體檢者,利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)上述各組MM患者及正常健康人的外周血清中miRNA-192-5p的表達(dá)水平;收集各組MM患者的血β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)、血鈣、白蛋白、血紅蛋白、血肌酐、乳酸脫氫酶、M蛋白、血輕鏈、尿輕鏈、FISH等相關(guān)臨床參數(shù),利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和pearson相關(guān)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析血清中miRNA-192-5p的表達(dá)與上述各種臨床參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)miRNA-192-5p在初發(fā)和臨床復(fù)發(fā)的MM患者血清中均為顯著低表達(dá);(2)利用ROC曲線評(píng)估m(xù)iRNA-192-5p對(duì)MM診斷效能,發(fā)現(xiàn)ROC曲線下面積為0.65,p=0.025,敏感性77%,特異性56%。(3)血β2-MG、血肌酐含量高的初發(fā)MM患者的血清miRNA-192-5p的表達(dá)水平分別低于血β2-MG、血肌酐含量低的患者。(4)血紅蛋白、白蛋白含量低的初發(fā)MM患者的血清miRNA-192-5p的表達(dá)水平分別低于血紅蛋白、白蛋白含量正常的患者。(5)miRNA-192-5p在初發(fā)MM患者血清中的表達(dá)水平分別與患者的血清Ig G、Ig A、κ及λ含量負(fù)相關(guān)。(6)miRNA-192-5p在有t(4;14)及13q14突變的初發(fā)MM患者血清中的表達(dá)水平顯著降低。(7)進(jìn)一步對(duì)50例初發(fā)MM患者進(jìn)行臨床追蹤發(fā)現(xiàn),未緩解組MM患者血清中miRNA-192-5p的表達(dá)水平明顯低于緩解組MM患者。這些結(jié)果表明了miRNA-192-5p在多發(fā)性骨髓瘤的診斷中雖只能作為一個(gè)輔助診斷標(biāo)準(zhǔn),但其在多發(fā)性骨髓瘤的疾病進(jìn)展監(jiān)測(cè)中可能是一個(gè)非常好的標(biāo)志物。第三部分:miRNA-192-5p在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制中的作用研究表明miRNA分子在MM的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。比如,miR-21可以通過(guò)SPRY2來(lái)調(diào)控MAPK/ERK信號(hào),介導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及耐藥產(chǎn)生;miR-148a可通過(guò)靶向CDKN1B和PTEN來(lái)調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。在前兩部分的研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-192-5p在MM患者外周血清中為低表達(dá),并且miR-192-5p的低水平與患者較重的疾病狀態(tài)和較差的預(yù)后相關(guān),但該分子在MM的發(fā)病機(jī)制中有何作用還需我們進(jìn)一步的探討。因此,本部分實(shí)驗(yàn)采用多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株LP-1作為細(xì)胞模型,轉(zhuǎn)染miR-192-5p mimic,過(guò)表達(dá)miR-192-5p,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù),探討miR-192-5p對(duì)MM細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):過(guò)表達(dá)miR-192-5p不僅可以誘導(dǎo)MM細(xì)胞的凋亡,還能明顯增強(qiáng)目前MM的主流化療藥物硼替佐米(Bortezomib,BTZ)對(duì)MM細(xì)胞的凋亡作用。另外,過(guò)表達(dá)miRNA-192-5p還可以抑制MM細(xì)胞的增殖,而且作用時(shí)間越長(zhǎng)、抑制效果越顯著。這些結(jié)果均表明,miRNA-192-5p可以抑制MM細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)MM細(xì)胞的凋亡,增強(qiáng)MM主流化療藥物BTZ的治療敏感性。在MM中miRNA-192-5p可能作為一種抑癌基因發(fā)揮作用,并有可能成為治療MM的潛在治療靶點(diǎn)。綜上所述,本課題通過(guò)芯片篩選、熒光定量PCR等技術(shù)證實(shí)miR-192-5p在MM患者外周血清中低表達(dá),并且miRNA-192-5p的異常表達(dá)可以作為MM的輔助診斷標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的標(biāo)志物。過(guò)表達(dá)miR-192-5p能誘導(dǎo)MM細(xì)胞的凋亡,抑制細(xì)胞的增殖,與BTZ聯(lián)合使用時(shí),還可以增強(qiáng)其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
[Abstract]:Multiple myeloma ( MM ) is a complicated malignant blood system disease characterized by abnormal clonal proliferation of plasma cells in bone marrow , and large amount of monoclonal immunoglobulin and fragments thereof . In order to solve these problems , it was found that miRNA - 192 - 5p can be detected in the serum of MM patients . The expression levels of miRNA - 192 - 5p , miR - 17 and miR - 18a in serum of MM patients with different stages of disease were analyzed . The correlation between miRNA - 192 - 5p and miRNA - 192 - 5p in patients with MM were analyzed . ( 5 ) The levels of miRNA - 192 - 5p were negatively correlated with the levels of serum Ig G , Ig A , kappa and 位 , respectively . It was found that miR - 192 - 5p plays an important role in the pathogenesis of MM . The results show that miR - 192 - 5p plays an important role in the pathogenesis of MM . The results show that miR - 192 - 5p plays an important role in the pathogenesis of MM .
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R733.3

【參考文獻(xiàn)】

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2 李倩;安剛;李承文;徐燕;鄧書(shū)會(huì);劉旭平;齊軍元;王亞非;鄒德慧;趙耀中;邱錄貴;;染色體13q14缺失在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生發(fā)展中的意義及對(duì)其臨床預(yù)后的影響[J];中華血液學(xué)雜志;2011年04期

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本文編號(hào)：1983973