發(fā)布時(shí)間：2018-05-31 09:41

  本文選題：成纖維細(xì)胞生長因子受體4 + 胃癌�。� 參考：《鄭州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一,在亞洲尤其是在我國的發(fā)病率甚高。在我國,早期胃癌的發(fā)現(xiàn)率約為20%,遠(yuǎn)低于韓國和日本等其他亞洲國家。胃癌的發(fā)現(xiàn)常在癌癥晚期或者因轉(zhuǎn)移性胃癌而被發(fā)現(xiàn)。在我國胃癌多為進(jìn)展期,并且預(yù)后比較差,常需要通過手術(shù)治療為主、放化療等為輔的綜合治療。目前,胃癌的輔助化療、姑息化療的方案很多,如順鉑+氟尿嘧啶、氟尿嘧啶+奧沙利鉑、DCF、ECF等,其中以氟尿嘧啶為基礎(chǔ)化療藥物。由于胃癌發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性和不確定性,目前胃癌治療的生存時(shí)間并不理想,無論是美國的NCCN指南還是歐洲腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)會(ESMO)均沒有治療胃癌的標(biāo)準(zhǔn)方案。盡管近年來靶向藥物在胃癌研究領(lǐng)域非常熱門,但是由于胃癌的發(fā)生發(fā)展一個(gè)是具有多因素、多階段和多種基因共同參與的過程,其發(fā)病機(jī)制并不清楚；目前除了赫塞丁外,多數(shù)藥物如貝伐珠單抗、愛必妥等藥物在胃癌研究中并未取得突破。所以尋找新的靶基因,闡明胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制對有效治療胃癌有著重要的作用。由近年來靶向藥物的相關(guān)研究可以看出,EGFR. VEGF等相關(guān)信號通路藥物在肺癌、乳腺癌等一些惡性腫瘤治療中取得了突破性進(jìn)展,但是這些研究對胃癌治療并無作用。因此尋求新的治療靶點(diǎn)是胃癌治療的一大任務(wù)。近年來,對于FGFR (Fibroblast growth factor recptor)的研究日益增多,成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFRs)是免疫球蛋白基因超家族成員,分布在多種細(xì)胞膜上,其中以FGFR4多肽性位點(diǎn)Gly388Arg研究最多。FGFR4基因編碼的蛋白是一類跨膜酪氨酸激酶受體,為分布在多種細(xì)胞上的膜蛋白。它對細(xì)胞的增殖、分化、創(chuàng)傷修復(fù)、血管生成、肌肉形成以及生長發(fā)育等都起著極其重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn),該種蛋白在多種腫瘤中均有表達(dá)異常,如胰腺癌、乳腺癌等,因此FGFR家族在惡性腫瘤診治方面有著廣闊的應(yīng)用前景。但迄今為止,FGFR4在胃癌中的研究很少,并且研究不夠深入。一些報(bào)道顯示BGJ398與FGFR家族有很好的親和力和選擇性,并且BGJ398能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖。有研究報(bào)道,BGJ398能夠通過抑制FGFR4酪氨酸磷酸化,從而起到抑制FGFR4活性的作用,與此同時(shí),BGJ398還能夠抑制FGFR1和FGFR3的活性。迄今發(fā)現(xiàn)的20多種成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)中有10個(gè)能與FGFR4結(jié)合,其中僅有FGF19與FGFR4特異性結(jié)合。FGFR4激活后能夠使FGF19促進(jìn)肝細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)肝癌形成。部分研究證明,BGJ398能夠逆轉(zhuǎn)FGF19特異性的刺激AFP產(chǎn)量增加,從而推測BGJ398能夠抑制FGFR4的活性。由于目前FGFR4在胃癌中的研究較少,因此本課題著重探討FGFR4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為胃癌的早期診斷、預(yù)后以及基因治療提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。通過體內(nèi)體外功能學(xué)檢測FGFR4在胃癌及癌旁正常組織中的表達(dá)異同,探討成纖維細(xì)胞生長因子受體4(FGFR4)在胃癌(GC)發(fā)生發(fā)展中的功能,并探討其治療價(jià)值。本課題前兩部分主要從基因水平、mRNA水平和蛋白水平上對FGFR4分子與胃癌的相關(guān)性進(jìn)行研究,并通過體外實(shí)驗(yàn),研究FGFR4對胃癌細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響；然后通過慢病毒構(gòu)建FGFR4 RNAi,用于裸鼠胃癌模型的建立,進(jìn)行TUNEL及免疫組化等體內(nèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn),檢測胃癌生物學(xué)特性相關(guān)蛋白以及表達(dá)變化。同時(shí)進(jìn)一步研究5-Fu、BGJ398單藥或聯(lián)合用藥干預(yù)慢病毒處理的細(xì)胞株,觀察其對胃癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響,從而探討這些藥物的作用機(jī)制,進(jìn)而更全面的研究FGFR4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為BGJ398應(yīng)用于胃癌臨床治療提供理論依據(jù),也為胃癌的預(yù)后提供新的評價(jià)指標(biāo)。第一部分成纖維細(xì)胞生長因子受體4在胃癌中作用的功能研究第一章成纖維細(xì)胞生長因子受體4在胃癌細(xì)胞系中作用的功能研究背景與目的：胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率占第四位。在我國,早期胃癌的發(fā)現(xiàn)率僅為20%,并且大多是在癌癥晚期或者因轉(zhuǎn)移性胃癌而被發(fā)現(xiàn),因此預(yù)后比較差,常需要以手術(shù)治療為主、放化療等為輔的綜合治療。目前,胃癌的輔助化療、姑息化療的方案很多,其中以鉑類和氟尿嘧啶為一線藥物,如順鉑+氟尿嘧啶、氟尿嘧啶+奧沙利鉑、DCF、ECF等,但其生存時(shí)間并不理想。近年來,靶向藥物在胃癌的治療中成為一大熱點(diǎn)。但除了赫塞丁外,多數(shù)藥物在胃癌研究中并未取得突破。所以尋找新的治療靶基因,闡明胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制對治療胃癌有著重要作用。成纖維細(xì)胞生長因子(FGFRs)是免疫球蛋白基因超家族成員,分布在多種細(xì)胞膜上,其中以FGFR4多肽性位點(diǎn)Gly388Arg研究最多。FGFR4編碼的蛋白是一類跨膜酪氨酸激酶受體,為主要分布在多種細(xì)胞上的膜蛋白。它對細(xì)胞的增殖、分化、創(chuàng)傷修復(fù)、血管生成、肌肉形成以及生長發(fā)育等都起著極其重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn),該種蛋白在多種腫瘤中均表達(dá)異常,如胰腺癌、乳腺癌等,因此FGFR家族在惡性腫瘤診治方面有著廣闊的應(yīng)用前景。但迄今為止,FGFR4在胃癌中的研究很少,并且研究不夠深入。本研究通過慢病毒載體介導(dǎo),構(gòu)建成FGFR4基因沉默細(xì)胞株,研究FGFR4基因沉默后對胃癌細(xì)胞系增殖能力、侵襲能力以及凋亡的影響。檢測不同處理組效應(yīng)蛋白表達(dá)的變化,探討FGFR4基因沉默后對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的機(jī)制。方法：利用Real-time PCR檢測FGFR4在胃癌細(xì)胞系HGC27、MKN45、MKN28、 MGC803、BGC823、SGC7901和293T中的表達(dá)情況,篩選出高表達(dá)細(xì)胞。構(gòu)建FGFR4基因沉默細(xì)胞株,通過CCK8檢測基因沉默細(xì)胞株和正常細(xì)胞株增殖情況的改變。流式細(xì)胞分選儀檢測FGFR4基因沉默后對胃癌細(xì)胞系凋七的影響,以及通過Transwell檢測其侵襲能力的改變。Western Blot檢測不同處理組效應(yīng)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：本研究構(gòu)建成功FGFR4基因沉默細(xì)胞株,分別設(shè)正常細(xì)胞組、陰性質(zhì)粒組以及FGFR4基因沉默細(xì)胞組。其中FGFR4基因沉默后的細(xì)胞組較正常組及陰性質(zhì)粒對照組的增值率和侵襲能力明顯降低,凋亡率增高,PCNA和Bcl-xl的表達(dá)降低。結(jié)論：本研究從不同惡性程度的胃癌細(xì)胞株中篩選出兩株FGFR4高表達(dá)細(xì)胞株,并通過慢病毒轉(zhuǎn)染將其構(gòu)建成FGFR4基因沉默胃癌細(xì)胞株,通過研究其基因沉默后細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力、凋亡情況以及以上指標(biāo)相關(guān)蛋白,發(fā)現(xiàn)FGFR4基因沉默后的胃癌細(xì)胞株增殖能力減弱、凋亡率增加、侵襲能力降低,提示FGFR4能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長,增加其惡性程度,促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲性。第二章成纖維細(xì)胞生長因子受體4在裸鼠成瘤中作用的研究背景與目的：FGFR4在常見的惡性腫瘤如胰腺癌、橫紋肌肉瘤、乳腺癌以及腎細(xì)胞癌中均呈高表達(dá)。迄今發(fā)現(xiàn)的20多種成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)中僅有10種能與FGFR4結(jié)合,其中僅FGF19能夠與FGFR4特異性結(jié)合。目前FGFR4在胃癌中的研究比較少,因此本課題著重探討FGFR4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為胃癌的早期診斷、預(yù)后以及基因治療提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。方法：將FGFR4基因沉默細(xì)胞株和相應(yīng)未處理的胃癌細(xì)胞株皮下注射至裸鼠背部,構(gòu)建裸鼠胃癌模型。接種6-8周后,觀測不同處理組成瘤體積、大小指標(biāo)的變化。通過TUNEL法檢測不同組的組織中細(xì)胞凋亡情況。通過免疫組化檢測增殖和凋亡相關(guān)蛋白,分析FGFR4基因沉默后其對胃癌組織生長的影響。結(jié)果：皮下注射FGFR4基因沉默后的HGC27和MKN45細(xì)胞株的裸鼠瘤體積明顯小于陰性對照組和空白對照組,且此差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。此差異尤其在細(xì)胞注射后第10天,13天和16天最為明顯。通過TUNEL法檢測組織中細(xì)胞凋亡情況,發(fā)現(xiàn)FGFR4基因沉默組細(xì)胞凋亡增加。通過免疫組織化學(xué)的方法檢測FGFR4基因沉默組的PCNA、BCL-XL表達(dá)降低,Caspase3的表達(dá)增高。結(jié)論：FGFR4基因沉默后能夠抑制胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的增長,增加細(xì)胞凋亡。所以,我們推測低表達(dá)FGFR4基因的蛋白可能會減緩?fù)砥谖赴┑倪M(jìn)展。第二部分成纖維細(xì)胞生長因子受體4抑制劑和5-Fu在胃癌中作用機(jī)制的研究背景與目的BGJ398與FGFR家族有很好的親和力和選擇性,并且BGJ398能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖。有研究報(bào)道,BGJ398能夠抑制FGFR4酪氨酸磷酸化,從而起到抑制FGFR4活性的作用,與此同時(shí),BGJ398還能夠抑制FGFR1和FGFR3的活性。迄今發(fā)現(xiàn)的20多種成纖維生長因子(FGF)中有10個(gè)能與FGFR4結(jié)合,其中僅有FGF19與FGFR4特異性結(jié)合。FGFR4激活后能夠使FGF19促進(jìn)肝細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)肝癌形成。部分研究證明,BGJ398能夠逆轉(zhuǎn)FGF19特異性的刺激AFP產(chǎn)量增加,從而推測BGJ398能夠抑制FGFR4的活性。此外,BGJ398對FGFR4高表達(dá)的肝癌細(xì)胞株HuH7d的抗增殖作用顯著強(qiáng)于FGFR4低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株及非癌細(xì)胞株,因此進(jìn)一步說明FGFR4相對于其他FGFRs亞型而言,BGJ398對其作用的影響更大。FGFR4在胃癌中的研究甚少,因此我們將著重探討FGFR4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法BGJ398和5-Fu單藥或兩藥聯(lián)合處理FGFR4基因沉默的細(xì)胞株,分別以各自未行處理的細(xì)胞株作為對照,進(jìn)行一系列體外功能學(xué)試驗(yàn),評價(jià)BGJ398和5-Fu對FGFR4低表達(dá)水平胃癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響。同時(shí)在分子水平上檢測不同處理因素作用后,細(xì)胞增殖,侵襲,凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：單用5-Fu和BGJ398以及兩藥聯(lián)合后對胃癌細(xì)胞MKN45和HGC27的細(xì)胞增殖起到抑制作用,且增加了細(xì)胞的凋亡率。將這兩株細(xì)胞通過轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建FGFR4基因沉默細(xì)胞株后,細(xì)胞對5-Fu和BGJ398以及兩藥聯(lián)合的敏感度增加,細(xì)胞增殖所受的抑制作用增加,凋亡率較未基因沉默的細(xì)胞株增加。結(jié)論：單用5-Fu和BGJ398以及兩藥聯(lián)合后對胃癌細(xì)胞株MKN45和HGC27的細(xì)胞增殖起到抑制作用,且增加細(xì)胞的凋亡率�；虺聊現(xiàn)GFR4能夠增加5-Fu和BGJ398對胃癌細(xì)胞株的增值抑制作用。全文結(jié)論：通過轉(zhuǎn)染慢病毒構(gòu)建FGFR4基因沉默胃癌細(xì)胞株,進(jìn)行體內(nèi)體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。FGFR4基因沉默后通過減少腫瘤細(xì)胞的侵襲能力和增殖能力來增加腫瘤細(xì)胞的凋亡,降低腫瘤的惡性程度。將5-Fu和BGJ398單用及兩藥聯(lián)合處理正常胃癌細(xì)胞株后,發(fā)現(xiàn)單用和聯(lián)合治療均能降低細(xì)胞增殖,增加細(xì)胞凋亡率。此細(xì)胞增殖的抑制作用和凋亡情況的增加在FGFR4基因沉默后的胃癌細(xì)胞株中更為明顯。但5-Fu和BGJ398的聯(lián)合治療的價(jià)值和前景還需要我們進(jìn)一步驗(yàn)證,為臨床提供治療依據(jù)。
[Abstract]:Gastric cancer is one of the most common malignant tumors in the world . In China , the incidence of gastric cancer is very high . In China , the rate of early gastric cancer is about 20 % , which is much lower than other Asian countries such as South Korea and Japan .
In addition to Herceding , most of the drugs , such as beatazuresis and Aibijing , have not made a breakthrough in the study of gastric cancer . Therefore , it is important to find a new target gene and to clarify the mechanism of development of gastric cancer . It can be seen that EGFR is a target drug in recent years . In recent years , it has been found that BGJ398 can inhibit FGFR4 activity . In recent years , it has been found that BGJ398 can inhibit FGFR4 activity .
Objective : To study the role of FGFR4 in gastric cancer , and to study the role of FGFR4 in gastric cancer . The expression of FGFR4 gene in gastric cancer cell line HGC27 , MKN45 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 , BGC823 , MKN28 , MGC803 and BGC823 were detected by Western Blot . Conclusion : BGJ398 can inhibit the growth of gastric cancer cells and increase cell apoptosis . In addition , BGJ398 can inhibit FGFR4 activity .
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1959182