本文選題：乳腺癌 + 小凹蛋白1��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分Caveolin-1在乳腺癌組織中的表達及與臨床病理特征的相關(guān)性目的:乳腺癌是一種嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤,全球每年新增乳腺癌患者超過120萬,年死亡人數(shù)大約40萬人,在我國的大中型城市,乳腺癌的發(fā)病率已經(jīng)居婦女常見惡性腫瘤的第一位,乳腺癌預(yù)后較差,影響預(yù)后的諸多因素中乳腺癌的復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是其預(yù)后不良的主要原因。HER-2也稱為ErbB-2,是細胞來源的癌基因,位于染色體17q21,編碼185KDa,是人類表皮生長因子受體家族的重要成員之一。HER-2蛋白由胞外區(qū)、親脂性跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,PTK)活性區(qū)三部分組成。有研究曾表明約30%乳腺癌患者發(fā)現(xiàn)HER-2過表達,且過表達常與乳腺癌的惡性度密切相關(guān),預(yù)示患者預(yù)后不良。Caveolae家族是細胞膜凹陷形成的凹陷結(jié)構(gòu)或微囊結(jié)構(gòu),在Caveolae蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)中,N端的腳手架結(jié)構(gòu)和可變的C端將其分為兩個胞漿區(qū),N端腳手架結(jié)構(gòu)域由高度保守的氨基酸序列構(gòu)成,Caveolae不僅主要通過此區(qū)域與膽固醇相互作用,而且還與各種信號分子的催化亞基結(jié)合,從而調(diào)節(jié)信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)。Caveolin-1是此結(jié)構(gòu)的標志性蛋白,近年來發(fā)現(xiàn),Caveolin-1與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個方面,如腫瘤的增殖,發(fā)生,凋亡,遷移,耐藥,轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)。在腫瘤發(fā)生和形成過程中,Caveolin-1通過調(diào)節(jié)多種信號傳導(dǎo)分子和通路的活性,影響細胞的分化、增殖、遷移和凋亡等。目前人們對Caveolin-1作用的認識有一定的提高,可是對于Caveolin-1的抑癌及腫瘤生成作用及其作用機制仍存在很多爭議。在包括乳腺癌在內(nèi)一些特定的腫瘤中,Caveolin-1被認為發(fā)揮抑癌功能,得到了大多數(shù)人的認可。然而對Caveolin-1在乳腺癌調(diào)控多種相關(guān)信號分子通路,抑制乳腺癌細胞的增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡的具體機理,尚不十分清楚,成為人們進一步研究的熱點,將成為腫瘤的診斷和治療新目標。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程是多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路互相作用互相調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程。在細胞的信號網(wǎng)絡(luò)中,PI3K/Akt通路是一條典型的抗凋亡通路,其中Akt又稱PKB,是該通路中一個重要的下游靶激酶。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路與腫瘤細胞增殖、浸潤與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。國內(nèi)外研究提示,Cav-1在乳腺癌中的作用可能與上述兩個信號通路有關(guān)。本研究擬應(yīng)用免疫組化、體外培養(yǎng)細胞、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、免疫蛋白印跡等實驗技術(shù),探討Caveolin-1參與乳腺癌的作用及其可能機制,從細胞、組織和分子水平綜合分析Caveolin-1對HER-2磷酸化的調(diào)控,探討Caveolin-1在Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路中的作用,為闡明乳腺癌發(fā)病機制提供新的實驗數(shù)據(jù),為有效預(yù)防和治療乳腺癌提供新的靶點方法:1采用非生物素酶二步(PV)免疫組織化學(xué)方法,檢測50例分化程度不同的浸潤性乳腺癌組織及正常乳腺組織中Caveolin-l的表達,探討其與乳腺癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系及對預(yù)后的意義。2了解Caveolin-l和磷酸化人類表皮生長因子受體2(p-HER-2)的表達情況,以正常乳腺組織或乳腺良性增生為陰性對照。結(jié)果:1免疫組化檢測Caveolin-1、HER-2、Ki-67在乳腺癌組織中的表達免疫組化結(jié)果顯示,Caveolin-1的陽性表達產(chǎn)物主要分布于乳腺上皮細胞的胞漿,呈現(xiàn)黃色-棕褐色顆粒。按判定標準Caveolin-1在正常乳腺組織中陽性表達的程度較強,在浸潤性乳腺癌組織中表達較少,其表達率分別為80%和32%,兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Ki-67的陽性表達產(chǎn)物主要分布于乳腺上皮細胞的胞核,HER-2的陽性表達產(chǎn)物主要分布于乳腺上皮細胞的胞膜,呈現(xiàn)黃色-棕褐色顆粒。2Caveolin-1、HER-2、Ki-67的表達與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,Caveolin-l在浸潤性乳腺癌中的表達水平隨淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而減低(P0.05),隨臨床TNM分期而減低(P0.05),各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Caveolin-l在浸潤性乳腺癌中的表達水平與患者年齡、腫瘤直徑、ER/PR、HER-2、Ki-67、及絕經(jīng)前后等表達無關(guān)。3乳腺癌Caveolin-l與p-HER-2的表達關(guān)系免疫組化結(jié)果顯示p-HER-2的陽性表達產(chǎn)物主要分布于乳腺上皮細胞的胞膜,呈現(xiàn)黃色-棕褐色顆粒。按判定標準p-HER-2在Caveolin-l低表達組中陽性表達的程度較強,在Caveolin-l高表達組中表達較少,其表達率分別為52.63%和16.67%,兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4Caveolin-1的表達與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性分析免疫組化結(jié)果顯示,在Caveolin-1表達陽性的患者中,5年生存率高于Caveoiin-1表達陰性的患者組。采用Kapian-Meier法進行生存分析,結(jié)果顯示Caveolin-1表達陽性的病例預(yù)后明顯好于Caveolin-1表達陰性的病例。第二部分Caveolin-1影響乳腺癌細胞生物學(xué)行為的的分子機制方法:1細胞復(fù)蘇和培養(yǎng)將MDA-MB-453細胞凍存管從液氮中取出,融化后用含10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100IU/ml的1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2質(zhì)粒提取用QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒,分別提取pcDNA3.1-Cav1和pcDNA3.1陰性對照質(zhì)粒,構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。設(shè)置MDA-MB-453組、pcDNA3.1-Cav1(Cav-1)轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染對照組,加嘌呤霉素進行抗性篩選,未轉(zhuǎn)染組細胞全部死亡。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Cav1質(zhì)粒的MDA-MB-453細胞即MDA-MB-453/Cav-1,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的MDA-MB-453細胞即MDA-MB-453/pcDNA3.1。3Westernblot和實時定量PCR驗證過表達Caveolin-1效果培養(yǎng)MDA-MB-453、MDA-MB-453/Cav-1和MDA-MB-453/pcDNA3.1細胞,待細胞長滿至培養(yǎng)皿的80%左右,用無胎牛血清的1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)4小時,收集細胞提取總蛋白,采用免疫印跡(Western-blot)法測定不同乳腺癌細胞中Caveolin-1蛋白的表達情況。將MDA-MB-453/Cav-1細胞MDA-MB-453/pcDNA3.1細胞和MDA-MB-453細胞分別接種于35mm培養(yǎng)皿中,利用實時定量PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中Caveolin-1mRNA的表達水平。4MTT法觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的增殖情況培養(yǎng)MDA-MB-453/pcDNA3.1、MDA-MB-453/Cav-1細胞,用MTT法檢測細胞增殖水平,每種細胞設(shè)四組分別予EGF(0nM、4nM、20nM、100nM)刺激細胞24小時后,用MTT比色分析法檢測分組乳腺癌細胞的增殖水平,記錄并分析結(jié)果。5采用劃痕修復(fù)實驗觀察穩(wěn)定細胞的遷移能力培養(yǎng)MDA-MB-453/pcDNA3.1、MDA-MB-453/Cav-1細胞,接種于24孔板,將兩種細胞分別分為無EGF刺激組和20nMEGF刺激組,利用顯微鏡下觀察并拍照0h、24h、48h、72h、96h后觀察劃痕愈合寬度的變化,計算細胞遷移率。6Transwellcellinvasionassay檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的侵襲能力培養(yǎng)MDA-MB-453/pcDNA3.1、MDA-MB-453/Cav-1細胞,在無血清的1640培基饑餓4h。利用膠均勻鋪在Transwell的小室,并常規(guī)HE染色,光鏡下拍照,統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)。采用Transwell法檢測細胞的侵襲能力,了解不同乳腺癌細胞的侵襲能力。結(jié)果:1乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞MDA-MB-453的Caveolin-1表達情況1.1Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后細胞Caveolin-1的蛋白表達水平Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后MDA-MB-453細胞Caveolin-1的蛋白水平。MDA-MB-453、MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1細胞Caveolin-1的表達水平分別為0.02±0.00,0.02±0.00,0.60±0.03,MDAMB-453/Cav-1細胞Caveolin-1的表達水平明顯高于對照組,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。1.2實時定量PCR檢測Caveolin-1的mRNA的表達水平實時定量PCR檢測MDA-MB-453穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞Caveolin-1mRNA的表達水平。MDA-MB-453、MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1細胞Caveolin-1的mRNA表達水平分別為1.00±0.00、1.12±0.05、7.09±0.43,MDA-MB-453/Cav-1細胞Caveolin-1的表達水平明顯高于對照組(1.00),差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。2乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞MDA-MB-453的增殖情況將乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞MDA-MB-453接種于96孔板,分別經(jīng)0nM、4nM、20nM、100nM刺激后,MTT法檢測各孔的OD值進行統(tǒng)計分析,MDA-MB-453/Cav-1組的OD值為0.80±0.07,0.86±0.03,0.93±0.03,1.00±0.03,均明顯低于對照組的OD值0.93±0.05,1.02±0.04,1.12±0.06,1.32±0.09,有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞MDA-MB-453的遷移情況利用相應(yīng)軟件測量劃痕寬度,計算細胞遷移率:細胞遷移率=(劃痕初始寬度-劃痕目前寬度)/2/劃痕初始寬度×100%。無EGF刺激時,MDA-MB-453/Cav-1細胞在24h、48h、72h、96h的遷移率(2.31±0.55,9.04±2.14,16.08±2.54,21.93±2.60)各時間點均明顯低于對照組(5.21±0.42,12.13±0.38,23.56±1.99,35.04±2.47),均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。給予20nMEGF刺激后,MDA-MB-453/Cav-1細胞的遷移率(4.80±0.48,11.90±0.98,19.50±2.53,27.71±2.06)各時間點均明顯高于無EGF刺激組(2.31±0.55,9.04±2.14,16.08±2.54,21.93±2.60),均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。4乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞MDA-MB-453的侵襲情況采用Transwell法檢測細胞的侵襲能力,MDA-MB-453/Cav-1組穿膜細胞數(shù)(16±2)明顯低于對照組(31±3),有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。第三部分Caveolin-1對乳腺癌細胞HER-2活化的影響方法:Westernblot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的Caveolin-1、4G10、HER-2、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、β-actin的蛋白表達情況。實驗分為兩組:pcDNA3.1-Cav1轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染對照組,培養(yǎng)并用嘌呤霉素篩選乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1細胞,每組分別于EGF刺激0min、5min、10min、30min后收集細胞,提取蛋白,Western-blot檢測各時間點Caveolin-1、4G10、HER-2、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、β-actin蛋白的表達情況,統(tǒng)計分析。結(jié)果:過表達Caveolin-1對乳腺癌細胞HER-2活化的影響統(tǒng)計結(jié)果顯示,pcDNA3.1-Cav1組各時間點Caveolin-1的表達水平(1.12±0.03,1.08±0.06,1.13±0.06,1.11±0.04)均明顯高于對照組(0.05±0.01,0.04±0.01,0.04±0.00,0.04±0.01)的表達水平,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);pcDNA3.1-Cav1組磷酸化HER-2分別于EGF刺激5min、10min、30min后的表達水平(0.98±0.04,0.50±0.03,0.20±0.01)均明顯低于對照組(1.25±0.03,1.07±0.03,0.50±0.02)的表達水平,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);pcDNA3.1-Cav1組磷酸化Akt分別于EGF刺激5min、10min、30min后的表達水平(0.50±0.01,0.67±0.03,0.42±0.01)均明顯低于對照組(0.85±0.05,1.20±0.08,0.82±0.04)的表達水平,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);pcDNA3.1-Cav1組磷酸化ERK分別于EGF刺激5min、10min、30min后的表達水平(0.58±0.01,0.80±0.03,0.45±0.01)均明顯低于對照組(0.93±0.02,1.10±0.06,0.72±0.05)的表達水平,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:1Caveolin-1在正常乳腺上皮細胞高表達;Caveolin-1在浸潤性乳腺癌組織中的表達較低。2Caveolin-1的高表達可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力,表明Caveolin-1對乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移具有抑制作用。3Cav-1通過調(diào)控乳腺癌細胞HER-2磷酸化水平,影響Ras/Raf/MAPK及PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,進而影響浸潤性乳腺癌的惡性程度和預(yù)后,以及乳腺癌細胞一系列生物學(xué)行為。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：1945228