本文選題：神經(jīng)膠質(zhì)瘤 + microRNA��； 參考：《湖南師范大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的:Mir-148a是一種重要的微小RNA(microRNA,miRNA),其表達(dá)水平的異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。通過(guò)前期對(duì)大樣本基因組數(shù)據(jù)的挖掘,建立了一個(gè)完整mRNAs和microRNAs的神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)分子預(yù)后模型,發(fā)現(xiàn)mir-148a和DLGAP1(discs,large homolog associated protein 1)在GBM中分別呈現(xiàn)高表達(dá)和低表達(dá)并與病人的生存相關(guān),生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)DLGAP1是mir-148a的潛在靶基因。本課題以人神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系為研究對(duì)象,研究mir-148a在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平的變化;構(gòu)建mir-148a過(guò)表達(dá)(pre-mir-148a)和mir-148a抑制表達(dá)(anti-mir-148a)慢病毒,篩選并建立穩(wěn)定高表達(dá)及抑制表達(dá)mir-148a的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系;研究mir-148a對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的影響;驗(yàn)證mir-148a與DLGAP1之間的靶向關(guān)系并研究其功能。為進(jìn)一步詮釋GBM發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制和應(yīng)用mir-148a作為GBM診斷和治療的新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。方法:1、運(yùn)用組織芯片及原位雜交的方法檢測(cè)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)中本mir-148a的表達(dá)水平,運(yùn)用qRT-PCR方法檢測(cè)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中mir-148a的表達(dá)水平;2、根據(jù)人mir-148a序列設(shè)計(jì)并合成前體mir-148a及mir-148a反向互補(bǔ)序列,構(gòu)建mir-148a過(guò)表達(dá)慢病毒和mir-148a抑制表達(dá)慢病毒;感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系并通過(guò)嘌呤霉素篩選及qRT-PCR檢測(cè)mir-148a表達(dá)水平,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中建立mir-148a過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系;3、通過(guò)edu實(shí)驗(yàn)、cck8實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)mir-148a對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響;通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)mir-148a對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)mir-148a對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡情況的影響。4、運(yùn)用組織芯片和免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)不同級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及正常對(duì)照腦組織中dlgap1的表達(dá),運(yùn)用qrt-pcr、westernblot方法檢測(cè)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中dlgap1的表達(dá);5、運(yùn)用生物信息學(xué)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證dlgap1是否是mir-148a的靶基因,并通過(guò)qrt-pcr、westernblot方法檢測(cè)感染了mir-148a過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)慢病毒的細(xì)胞系中靶基因mrna水平和蛋白水平的變化;通過(guò)transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證mir-148a通過(guò)靶向調(diào)控dlgap1促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲。結(jié)果:1、mir-148a在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和正常腦組織中均有表達(dá),與正常腦組織中的mir-148a表達(dá)水平相比較,不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織中mir-148a表達(dá)上調(diào),腫瘤組織與正常組織之間的mir-148a的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與在組織中mir-148a表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果相似,mir-148a在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞ha1800和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系u87、u251、bt325、t98g、swo38-c2中均有表達(dá),與ha1800中mir-148a表達(dá)水平相比較,mir-148a在u87、u251、bt325、t98g、swo38-c2中的表達(dá)明顯上調(diào),腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的mir-148a的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2、成功構(gòu)建了mir-148a過(guò)表達(dá)慢病毒載體及mir-148a抑制表達(dá)慢病毒載體,并通過(guò)嘌呤霉素篩選及qpcr獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)mir-148a及抑制表達(dá)mir-148a的u87、u251、bt325、t98g穩(wěn)定細(xì)胞系。3、cck8實(shí)驗(yàn)、edu實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)mir-148a過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)u87、u251、bt325、t98g細(xì)胞的增殖,mir-148a表達(dá)下調(diào)抑制u87、u251、bt325、t98g細(xì)胞的增殖;劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell遷移實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)mir-148a過(guò)表達(dá)促進(jìn)u87、u251、bt325的遷移和侵襲,抑制mir-148a表達(dá)時(shí)抑制了u87、u251、bt325的遷移和侵襲;annexinvpe/7-aad染色檢測(cè)凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir-148a過(guò)表達(dá)抑制u87、bt325、t98g的凋亡,而mir-148a下調(diào)時(shí)促進(jìn)了u87、bt325的凋亡。4、dlgap1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中均有表達(dá),相比較與正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,dlgap1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),包括基因水平和蛋白水平,dlgap1在正常細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示dlgap1陽(yáng)性率隨神經(jīng)膠質(zhì)瘤良惡性級(jí)別的增高而相應(yīng)減少,不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤之間的dlgap1表達(dá)水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);靶基因預(yù)測(cè)到mir-148a與dlgap1之間存在靶向相關(guān)性,構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,通過(guò)與mir-148a過(guò)表達(dá)慢病毒共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞,熒光素酶報(bào)告基因熒光強(qiáng)度減弱,即活性降低,證明mir-148a可以直接作用于dlgap1-3’utr靶序列,下調(diào)dlgap1的表達(dá);qpcr、westernblot驗(yàn)證表明mir-148a過(guò)表達(dá)時(shí)抑制dlgap1基因水平、蛋白水平的表達(dá),mir-148a表達(dá)下調(diào)時(shí),dlgap1基因水平、蛋白表達(dá)水平上調(diào),證實(shí)mir-148a對(duì)dlgap1存在調(diào)控作用;shrna-dlgap1慢病毒載體感染u87、u251、bt325后進(jìn)行transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)dlgap1受到抑制時(shí)u87、u251、bt325的遷移、侵襲能力增強(qiáng)。結(jié)論:1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中,mir-148a高表達(dá)、dlgap1低表達(dá),兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性;mir-148a靶向抑制DLGAP1的表達(dá);2、成功構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)mir-148a及抑制表達(dá)mir-148a的穩(wěn)定細(xì)胞系;3、mir-148a促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲,抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡;4、DLGAP1是mir-148a的一個(gè)靶基因;mir-148a通過(guò)靶向調(diào)控DLGAP1促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of mir - 148a on glioma cell proliferation , apoptosis , migration and invasion ability of glioma cells . The expression of mir - 148a in glioma and normal brain tissues was significantly higher than that of mir - 148a in normal brain tissues . The expression level of mir - 148a was significantly higher than that of mir - 148a in normal brain tissues . The results showed that the expression of dlgap1 and dlgap1 in glioma cells decreased significantly ( p < 0.05 ) . mir - 148a promotes migration and invasion of glioma cells by targeting the DLGAP1 .
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R739.4
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本文編號(hào)：1945256