發(fā)布時間：2018-05-27 04:17

  本文選題：β-arrestin2 + CXCR4�。� 參考：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是指發(fā)生于結(jié)腸或直腸中的癌癥,是最常見的惡性腫瘤類型之一,其發(fā)病率逐年升高。結(jié)直腸癌預后與腫瘤分期密切相關(guān),已經(jīng)出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的晚期患者五年生存率低于15%。其中結(jié)直腸癌肝臟轉(zhuǎn)移(Colorectal cancer liver metastasis,CRCLM)是導致患者死亡的重要原因,有 20-25%的結(jié)直腸癌患者初次確診時已存在同時性肝轉(zhuǎn)移(Synchronous liver metastasis)。即使對于根治性手術(shù)切除后的早期患者,仍然約有30%最終出現(xiàn)異時性肝轉(zhuǎn)移(Metachronous liver metastasis),對于CRCLM患者的治療方案取決于具體的臨床狀況和多學科評估,在患者耐受的情況下,手術(shù)切除仍然為最佳治療策略。但即使對原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶均進行手術(shù)切除,患者術(shù)后肝內(nèi)復發(fā)率仍然居高不下。因此對CRCLM患者的治療及預后評估是提升結(jié)直腸癌整體生存率的關(guān)鍵。CRCLM是一個十分復雜的生物學過程,從解剖學的角度看,消化道的靜脈血流匯入門靜脈并進入肝臟,因此肝臟是消化道腫瘤細胞最容易著床的臟器,癌細胞脫落并進入血循環(huán)后,很容易在肝臟形成轉(zhuǎn)移灶。從腫瘤細胞的角度看,影響腫瘤轉(zhuǎn)移的因素包括細胞黏附、細胞增殖、細胞遷移侵襲、腫瘤微環(huán)境等。雖然結(jié)直腸癌肝臟轉(zhuǎn)移的分子生物學機制尚不完全明確,但普遍認為趨化因子-趨化因子受體(Chemokine receptor)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程發(fā)揮重要作用。CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4)是一種重要的趨化因子受體家族成員,屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors,GPCRs)家族,可被多種趨化因子激活并介導腫瘤細胞遷移過程。CXCR4最主要的配體為CXCL12(C-X-C motif chemokine 12),又稱為 SDF-1(Stromal cell-derived factor 1)。腫瘤細胞表面受體CXCR4受到SDF-1刺激后,可激活G蛋白偶聯(lián)的信號通路,調(diào)控下游EMT分子的表達及腫瘤細胞生物學特性。CXCR4被激活后會迅速發(fā)生由β-arrestin2蛋白所介導的受體內(nèi)吞過程,該內(nèi)吞過程受到CXCR4和β-arrestin2蛋白的磷酸化、泛素化等翻譯后修飾(Post-translational modification,PTM)調(diào)控。泛素特異性蛋白酶USP33(Ubiquitin-specific protease 33)屬于泛素特異性蛋白酶家族(Ubiquitin-specific proteases,USPs)成員之一,能夠調(diào)控底物的"去泛素化"過程,拮抗泛素連接酶(Ubiquitin ligases)所介導的泛素化修飾。USP33已被報道可參與調(diào)控多種GPCR的內(nèi)吞過程,包括β2腎上腺素受體(β2 adrenergic receptor,β2AR)和血管加壓素受體 II(Vasopressin receptor type 2,V2R)等;但 USP33 在腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究較少,其在結(jié)直腸癌中的表達、功能和分子生物學機制仍需進一步探索。本研究首次探索了 USP33在CRCLM患者腫瘤組織中的表達變化,分析其與患者臨床病理特征和預后的相關(guān)性,證實USP33蛋白表達水平對CRCLM患者預后的指導意義。此外,本課題表明USP33可抑制β-arrestin2所介導的CXCR4內(nèi)吞過程,阻斷其下游β-arrestin2依賴性ERK通路,從而下調(diào)結(jié)直腸癌細胞EMT蛋白表達及侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究不僅進一步明確了 USP33調(diào)控結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制,同時也闡明了 β-arrestin依賴性的GPCR信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用。第一部分泛素特異性蛋白酶USP33與結(jié)直腸癌臨床病理特征和預后的相關(guān)性[目的]檢測CRCLM患者腫瘤組織(原發(fā)腫瘤和肝轉(zhuǎn)移腫瘤)中USP33的表達,并分析其與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性,同時統(tǒng)計學分析評估USP33對CRCLM患者的總生存率(Overall survival,OS)和無病生存率(Disease-free survival,DFS)的預測價值。[方法]1.收集山東大學齊魯醫(yī)院、山東大學千佛山醫(yī)院、單縣中心醫(yī)院和鄆城市人民醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤(CRC)、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移腫瘤(CRCLM)及對應癌旁石蠟組織,并制成石蠟組織切片,進行免疫組織化學染色實驗檢測腫瘤組織及癌旁組織中USP33的蛋白表達及亞細胞定位,統(tǒng)計分析其與腫瘤病理特性、病人分期等相關(guān)性。2.收集山東大學齊魯醫(yī)院、山東大學千佛山醫(yī)院、單縣中心醫(yī)院和鄆城市人民醫(yī)院手術(shù)切除的CRC、CRCLM及對應癌旁新鮮組織,運用逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(Reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)手段檢測腫瘤組織及癌旁組織中USP33的mRNA水平。3.收集山東大學齊魯醫(yī)院、山東大學千佛山醫(yī)院、單縣中心醫(yī)院和鄆城市人民醫(yī)院手術(shù)切除的CRC、CRCLM及對應癌旁新鮮組織,利用蛋白免疫印跡(Western blot)手段檢測腫瘤組織及癌旁組織中USP33的蛋白水平。4.回顧性統(tǒng)計分析病人生存資料,記錄其總生存時間和無病生存時間,進行Kaplan-meier生存分析和Cox多因素風險回歸分析,尋找影響CRCLM患者預后的危險因素。[結(jié)果]1.收集139例CRCLM患者手術(shù)切除石蠟組織,免疫組織化學染色結(jié)果表明,USP33主要定位于細胞質(zhì)中,且在CRC及CRCLM腫瘤組織中表達水平均低于對應的癌旁組織。CRC中的USP33蛋白水平與CRC浸潤深度、肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān);CRCLM中的USP33蛋白水平與原發(fā)腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。2.收集14例CRCLM患者手術(shù)切除新鮮組織及對應癌旁組織,RT-qPCR結(jié)果顯示,有9例(9/14,64.3%)患者CRC組織中USP33的mRNA水平低于癌旁結(jié)直腸組織,有12例(12/14,85.7%)患者CRCLM中USP33的mRNA水平低于癌旁肝臟組織。3.14例CRCLM患者手術(shù)切除新鮮組織及對應癌旁組織的Western blot結(jié)果表明,有10例(10/14,71.4%)患者原發(fā)灶中USP33的蛋白水平低于癌旁結(jié)直腸組織,有12例(12/14,85.7%)患者肝轉(zhuǎn)移灶中USP33的蛋白水平低于癌旁肝臟組織。該結(jié)果基本與mRNA檢測結(jié)果一致。4.單因素分析結(jié)果顯示,CRCLM的分布、CRCLM數(shù)目、CRCLM最大腫瘤直徑、分化程度、手術(shù)切緣均可影響CRCLM患者的總生存率;此外,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝外轉(zhuǎn)移以及USP33在腫瘤組織中的表達水平,也可影響患者的整體預后生存。影響患者腫瘤復發(fā)的因素包括:CRC浸潤深度、CRCLM分布、CRCLM數(shù)目、CRCLM最大腫瘤直徑、分化程度、手術(shù)切緣、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,以及CRCLM中USP33的表達水平。多因素分析進一步證實CRCLM中USP33的蛋白表達水平可作為獨立預后因素提示患者總生存及無病生存狀況。[結(jié)論]1.USP33在結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤及肝轉(zhuǎn)移腫瘤中的表達水平均低于對應癌旁組織,其可能在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用。2.USP33與CRCLM病理特征及分期明顯相關(guān),USP33表達量低提示腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移作用更強。3.USP33在CRCLM中的表達水平可作為獨立危險因素提示患者預后。第二部分USP33調(diào)控結(jié)直腸癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移作用的研究[目的]基于第一部分臨床結(jié)果表明,USP33在CRC組織和CRCLM組織中表達量均低于癌旁正常組織,且其表達水平與腫瘤分期密切相關(guān)。本部分研究通過體外細胞實驗進一步驗證USP33在結(jié)直腸癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。[方法]1.選用正常結(jié)直腸上皮細胞和多種結(jié)直腸癌細胞系,應用Western blot的方法,檢測USP33的表達水平差異。2.構(gòu)建帶有HA標簽的pcDNA3.1-USP33高表達質(zhì)粒(HA-USP33)及空白對照質(zhì)粒(Vector),訂購USP33特異性小干擾RNA(USP33-siRNA)及對照組siRNA(Negative control siRNA,NC-siRNA),分別轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細胞以構(gòu)建 USP33高表達及低表達細胞系,并利用Western blot的方法檢測轉(zhuǎn)染效率。3.對轉(zhuǎn)染后的USP33高表達及低表達細胞分別進行光學顯微鏡下觀察,確定其是否存在細胞形態(tài)改變等表型變化。對細胞進行SDF-1刺激,利用Western blot方法檢測EMT相關(guān)蛋白的表達變化。4.利用USP33高表達及低表達的細胞系,對細胞進行SDF-1刺激,進行MTT實驗檢測USP33對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響;進行劃痕實驗(Wound healing assay)和Transwell實驗分別檢測USP33對腫瘤細胞遷移侵襲能力的影響。[結(jié)果]1.USP33在正常結(jié)腸上皮細胞NCM460細胞中的表達量顯著高于其在結(jié)直腸癌細胞系(SW620細胞、SW480細胞、LoVo細胞)中的表達水平。在三種結(jié)腸癌細胞系中,SW620細胞的USP33表達量最低,SW480細胞表達量最高,LoVo細胞表達量居中。2.成功構(gòu)建質(zhì)粒HA-USP33,并選用LoVo細胞系分別進行HA-USP33及USP33-siRNA轉(zhuǎn)染,經(jīng)Western blot驗證轉(zhuǎn)染效率及USP33蛋白表達水平。3.光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),USP33高表達可抑制LoVo細胞由上皮細胞形態(tài)向間質(zhì)細胞形態(tài)轉(zhuǎn)化。Western blot結(jié)果顯示,USP33高表達可抑制EMT標志性蛋白表達(β-catenin,N-cadherin,Snail,Slug,Twist1),同時上調(diào)上皮細胞標志物 E-cadherin的表達;而USP33低表達細胞則呈現(xiàn)與上述結(jié)果相反的EMT蛋白變化趨勢。4.MTT實驗結(jié)果證實USP33可抑制LoVo細胞的增殖能力,劃痕實驗和Transwell實驗表明USP33可抑制結(jié)直腸癌細胞的遷移侵襲能力。[結(jié)論]1.USP33可抑制SDF-1誘導的結(jié)直腸癌細胞的EMT過程。2.USP33可抑制SDF-1誘導的結(jié)直腸癌細胞遷移侵襲過程。第三部分USP33抑制結(jié)直腸癌細胞腫瘤生物學特性的分子機制研究[目的]上述研究已證實USP33可通過下調(diào)EMT蛋白進而抑制結(jié)直腸癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程,本部分實驗將從分子生物學角度入手,進一步探索USP33調(diào)控結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機制。[方法]1.檢測SDF-1所對應的趨化因子受體CXCR4在臨床病理組織(CRC組織,CRCLM組織及對應癌旁組織)中的表達情況。2.應用RT-qPCR和Western blot的手段,分別檢測CXCR4在不同結(jié)直腸癌細胞系中的mRNA及蛋白水平。3.構(gòu)建USP33失活突變(C214S/H683Q),并將其克隆入HA-pcDNA3.1載體質(zhì)粒中(HA-USP33Cys:His),對LoVo 細胞進行 HA-USP33Cys His 轉(zhuǎn)染。4.對轉(zhuǎn)染HA-USP33Cys:His的LoVo細胞分別進行MTT實驗和Transwell實驗,以探索USP33的去泛素化酶活性對其抑癌功能的影響。5.利用細胞表面受體ELISA的手段,檢測USP33對CXCR4受體的內(nèi)吞、降解及再循環(huán)回膜過程的影響。6.通過免疫共沉淀實驗,探索USP33與β-arrestin2的相互作用,并檢測USP33對β-arrestin2泛素化水平及蛋白降解的影響。7.檢測β-arrestin2在臨床病理組織(CRC組織,CRCLM組織及對應癌旁組織)中的表達情況,并進行統(tǒng)計學檢驗,評估其與USP33表達水平的相關(guān)性。8.利用 Western blot 的手段,檢測 USP33 對 CXCR4 下游 ERK(Extracellular signal-regulated kinases)通路的影響。通過對細胞進行內(nèi)吞抑制劑(Dynasore)預處理,驗證USP33是否通過調(diào)控CXCR4內(nèi)吞過程從而影響下游ERK通路。9.對USP33低表達的LoVo細胞進行內(nèi)吞抑制劑預處理,并給予SDF-1刺激,通過MTT和Transwell實驗分別檢測CXCR4內(nèi)吞失調(diào)對結(jié)直腸癌細胞增殖和遷移侵襲能力的影響。[結(jié)果]1.CXCR4在CRC組織中的表達量高于癌旁結(jié)直腸組織,CXCR4在CRCLM組織中的表達量高于癌旁肝臟組織。2.CXCR4在不同結(jié)直腸癌細胞系中的mRNA水平對比如下:SW480LoVoSW620。Western blot檢測的蛋白水平差異與mRNA結(jié)果基本一致。3.經(jīng)DNA測序證實HA-USP33Cys:His質(zhì)粒構(gòu)建成功,經(jīng)Western blot實驗證實HA-USp33Cys:His 轉(zhuǎn)染成功。4.MTT及Transwell實驗顯示HA-USP33能夠抑制LoVo細胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力,而HA-USP33Cys:His轉(zhuǎn)染并不能抑制LoVo細胞的腫瘤生物學特性。5.USP33可抑制SDF-1刺激后的CXCR4受體內(nèi)吞及降解過程。6.免疫沉淀實驗表明,SDF-1刺激后,USP33可與β-arrestin2蛋白結(jié)合,并下調(diào)β-arrestin2的泛素化水平,但USP33并不影響β-arrestin2的總蛋白水平。7.β-arrestin2在CRC和CRCLM腫瘤組織中的表達量均高于癌旁正常組織,但統(tǒng)計學分析并未發(fā)現(xiàn)β-arrestin2與USP33蛋白水平的顯著相關(guān)性。8.USP33低表達能夠延長CXCR4下游的ERK活化持續(xù)時間,但給予內(nèi)吞抑制劑預處理后,該延長作用消失。9.USP33-siRNA可增強LoVo細胞的增殖和遷移侵襲能力,而給予內(nèi)吞抑制劑預處理后,該作用被顯著削弱。[結(jié)論]1.USP33的去泛素化酶活性是其發(fā)揮抑癌作用的關(guān)鍵。2.USP33可下調(diào)β-arrestin2的泛素化水平,且其泛素化修飾可能影響β-arrestin2的蛋白活性,而非蛋白降解。3.USP33通過下調(diào)β-arrestin2的泛素化,抑制CXCR4的內(nèi)吞過程,致使SDF-1刺激后的CXCR4僅脫敏(desensitization)但不內(nèi)吞,從而阻滯了 CXCR4內(nèi)吞后由β-arrestin2 介導的 ERK 活化(β-arrestin-mediated ERK signaling),進而下調(diào)結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲能力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34
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本文編號：1940382