本文選題：Vγ9Vδ2T細(xì)胞 + 骨肉瘤　； 參考：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤。采用手術(shù)、新輔助化療等綜合治療方案后,療效有了顯著提高,但是仍有30%-50%的局部骨肉瘤終將復(fù)發(fā)；對(duì)于復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性骨肉瘤,目前尚無有效方法,療效極差。盡管新輔助化療結(jié)合手術(shù)已可將骨肉瘤患者的5年生存率提高到60%一80%,但近30年來患者的生存率始終沒有進(jìn)一步的提高。骨肉瘤的治療現(xiàn)狀促使科學(xué)家們探索新的致病機(jī)制和治療手段,以進(jìn)一步提高骨肉瘤的治愈率。自從上世紀(jì)80年代起,免疫治療作為繼手術(shù)、化療、放療之后第四大治療模式獲得越來越多的重視,被視為治療惡性腫瘤的一道曙光。我們?cè)谥暗难芯恐邪l(fā)現(xiàn),Vγ9Vδ2T細(xì)胞聯(lián)合唑來膦酸在體內(nèi)體外都可以有效殺傷骨肉瘤細(xì)胞,并詳細(xì)研究了可能涉及的途徑和機(jī)制。因而我們考慮將Vγ9Vδ2T細(xì)胞作為骨肉瘤免疫治療的效應(yīng)細(xì)胞,探索骨肉瘤免疫治療的新路徑。本次研究主要分三部分：一、我們檢測(cè)分析了外周血單個(gè)核細(xì)胞在ZOL和IL-2刺激下,Vγ9Vδ2T細(xì)胞擴(kuò)增表型的變化。我們發(fā)現(xiàn),體外擴(kuò)增的Vγ9Vδ2T細(xì)胞經(jīng)歷了“量”和“質(zhì)”的改變。在體外擴(kuò)增的前期,Vγ9Vδ2T細(xì)胞的殺傷作用隨著數(shù)量和比例的升高而逐漸增強(qiáng),并在12天至18天達(dá)到峰值。此時(shí)的Vγ9Vδ2T細(xì)胞殺傷活性最強(qiáng)而細(xì)胞數(shù)量十分充足,細(xì)胞表型為效應(yīng)細(xì)胞表型,適合作為殺傷腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞。二、我們研究了曲妥珠單抗TTZ介導(dǎo)的Vγ9Vδ2 T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的體外殺傷作用。我們發(fā)現(xiàn),人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)的表達(dá)是TTZ結(jié)合到OS細(xì)胞上的先決條件,骨肉瘤U20S細(xì)胞系顯示中度HER2表面表達(dá),而HOS細(xì)胞系只有低度HER2表面表達(dá)。TTZ共培養(yǎng)在U20S細(xì)胞系中誘導(dǎo)ADCC,然而在HOS細(xì)胞系中(低HER2表面表達(dá))沒有觀察到明顯的ADCC效應(yīng)。三、我們研究了曲妥珠單抗聯(lián)合唑來膦酸刺激Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的體外殺傷作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增的Vγ9Vδ2T細(xì)胞具有ADCC潛能,并且它們的抗腫瘤活性可以顯著地被單克隆抗體(monoantibody, mAb)共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞所增強(qiáng)。TTZ是一種人源化的mAb,可以結(jié)合HER2的細(xì)胞外區(qū)域。Vγ9Vδ2T細(xì)胞聯(lián)合TTZ和唑來膦酸可以對(duì)HER2陽性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生更大的細(xì)胞毒性作用。因此,我們的研究結(jié)果表明,Vγ9Vδ2T細(xì)胞聯(lián)合ZOL具有抑制骨肉瘤的作用,而且這種作用可以被TTZ的聯(lián)合應(yīng)用所增強(qiáng)。這項(xiàng)研究可以提供Vγ9Vδ2T細(xì)胞過繼性免疫治療OS,聯(lián)合使用ZOL和TTZ的理論依據(jù),為骨肉瘤的多途徑聯(lián)合免疫治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。第一部分Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的體外擴(kuò)-增、純化及表型鑒定目的：利用外周血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增Vγ9Vδ2T細(xì)胞,分析不同時(shí)間點(diǎn)的表型及純度,利用免疫磁珠純化細(xì)胞。方法：將健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞使用Zol+IL-2刺激并體外擴(kuò)增,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Vγ9Vδ2T細(xì)胞表型及純度,用LDH法檢測(cè)Vγ9Vδ2T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。結(jié)果：健康志愿者的外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng),Vγ9Vδ2T細(xì)胞純度、殺傷活性逐漸增加,細(xì)胞表型由幼稚型向效應(yīng)性轉(zhuǎn)變。體外擴(kuò)增的Vγ9Vδ2T細(xì)胞經(jīng)歷了“量”和“質(zhì)”的改變。12天到18天左右的Vγ9Vδ2T細(xì)胞殺傷活性最強(qiáng)而細(xì)胞數(shù)量十分充足,適合作為殺傷腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞。結(jié)論：體外擴(kuò)增Vγ9Vδ2T細(xì)胞經(jīng)歷了“量”和“質(zhì)”的改變,表型和殺傷能力檢測(cè)均表明12天到18天左右的細(xì)胞殺傷活性最佳,適合作為殺傷腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞。第二部分曲妥珠單抗介導(dǎo)的Vγ9Vδ2 T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的體外殺傷作用目的：觀察曲妥珠單抗能否增強(qiáng)Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的體外殺傷作用。方法：提取健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞,利用ZOL和IL-2體外擴(kuò)增14天后,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Vγ9Vδ2T細(xì)胞純度,并檢測(cè)CD16在Vγ9Vδ2T細(xì)胞上的表達(dá)情況。檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞表面分子HER2的表達(dá)水平。應(yīng)用MTS法檢測(cè)曲妥珠單抗刺激Vγ9Vδ2T細(xì)胞在體外殺傷骨肉瘤細(xì)胞系HOS和U20S的活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)后Vγ9Vδ2T細(xì)胞CD107a和胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ水平。結(jié)果：骨肉瘤U20S細(xì)胞系顯示中度HER2表面表達(dá),而HOS細(xì)胞系只有低度HER2表面表達(dá)。在4小時(shí)MTS中觀察到在0-400μg/ml的濃度范圍,TTZ無法單獨(dú)抑制Os細(xì)胞的增殖,即使到72小時(shí)也一樣。TTZ共培養(yǎng)在U20S細(xì)胞系中誘導(dǎo)ADCC,然而,在HOS細(xì)胞系中(低HER2表面表達(dá))沒有觀察到明顯的ADCC效應(yīng)。結(jié)論：TTZ能夠增強(qiáng)Vy9Vδ2T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的體外殺傷作用。在U20S細(xì)胞系可以誘發(fā)顯著的ADCC效應(yīng),在HOS細(xì)胞系中沒有誘發(fā)顯著的ADCC效應(yīng)。第三部分曲妥珠單抗聯(lián)合唑來膦酸刺激Vγ9Vδ2 T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的體外殺傷作用目的：觀察曲妥珠單抗聯(lián)合唑來膦酸能否增強(qiáng)Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的體外殺傷作用,并進(jìn)行Vγ9Vδ2T細(xì)胞殺傷骨肉瘤細(xì)胞的阻斷機(jī)制研究。方法：提取健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞,利用唑來膦酸(ZOL)和IL-2體外擴(kuò)增14天后,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Vγ9Vδ2T細(xì)胞純度,并檢測(cè)CD16、CD45RA、CD27在Vγ9Vδ2T細(xì)胞上的表達(dá)情況。檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞表面分子HER2的表達(dá)水平。應(yīng)用MTS法檢測(cè)曲妥珠單抗聯(lián)合唑來膦酸刺激Vγ9Vδ2T細(xì)胞在體外殺傷骨肉瘤細(xì)胞系HOS和U20S的活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)后Vγ9Vδ2T細(xì)胞CD107a和胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ水平。應(yīng)用不同阻斷劑分別阻斷Vγ9Vδ2T細(xì)胞以觀察其殺傷骨肉瘤細(xì)胞的機(jī)制。結(jié)果：我們模擬臨床環(huán)境腫瘤細(xì)胞使用ZOL(可以達(dá)到腫瘤患者中16毫克ZOL輸注達(dá)成的效果)預(yù)處理2小時(shí),Vγ9Vδ2T細(xì)胞介導(dǎo)ZOL致敏U20S目標(biāo)細(xì)胞的死亡率平均為32.0%,與單獨(dú)ZOL預(yù)處理組的比值為5：1。TTZ增強(qiáng)了Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)ZOL致敏U20S的細(xì)胞毒性作用,此外,TTZ明顯增強(qiáng)Vγ9Vδ2T細(xì)胞中的CD107a表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明,Vγ9Vδ2T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷作用,可以進(jìn)一步通過TTZ和ZOL來提高。在共培養(yǎng)前30分鐘將抗體加入到Vγ9Vδ2T細(xì)胞。使用CMA和抗泛γδT細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞的治療中發(fā)現(xiàn),Vγ9Vδ2T細(xì)胞的細(xì)胞毒性是TCR依賴和穿孔素介導(dǎo)的(分別78.4%和83.4%的抑制率)。使用抗NKG2D抗體只能減少6.9%的細(xì)胞毒性作用,表明NKG2D不是TTZ和ZOL增強(qiáng)Vγ9Vδ2T細(xì)胞毒性作用的原因。結(jié)論：TTZ聯(lián)合ZOL能夠增強(qiáng)Vγ9Vδ2T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的體外殺傷作用,并且Vγ9Vδ2T細(xì)胞的細(xì)胞毒性是TCR依賴和穿孔素介導(dǎo)的,NKG2D不是TTZ和ZOL增強(qiáng)Vγ9Vδ2T細(xì)胞毒性作用的原因。
[Abstract]:Osteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor . After surgery , neoadjuvant chemotherapy and other comprehensive treatment protocols , the curative effect is obviously improved , but still 30 % -50 % of the local osteosarcoma will relapse ;
In this study , we have studied the effect of V緯9V 未2T cells on osteosarcoma cells in vitro . In vitro amplification of V.緯9V未2T cells showed the best cytotoxicity against osteosarcoma cells .
In vitro killing effect of V.緯V未2T cells on osteosarcoma cells was observed by flow cytometry .
The results showed that the cytotoxicity of V.緯V未2T cells was 32.0 % . The results showed that the cytotoxic effect of V.緯9V未2T cells on ZOL - induced cytotoxicity was increased by using different blocking agents . The results showed that the cytotoxicity of V.緯9V未2T cells was increased by 60.9 % . Conclusion : The cytotoxic effect of V緯9V未2T cells on the cytotoxicity of V緯9V未2T cells was enhanced .
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R738.1

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9 朱U，

本文編號(hào)：1925463