本文選題：阿霉素 + CD44st�。� 參考：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的:1.應(yīng)用阿霉素(doxorubicin)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥,以此耐藥誘導(dǎo)模型為基礎(chǔ)檢測(cè)MDR1CD44st表達(dá)變化,探討阿霉素誘導(dǎo)獲得性多藥耐藥與腫瘤侵襲相關(guān)基因及其蛋白表達(dá)的關(guān)系;2.從MDR1CD44st基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控入手,檢測(cè)誘導(dǎo)獲得性多藥耐藥過程中,轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)核移位及其與DNA的結(jié)合活性的變化,探討NF-κB對(duì)MDR1CD44st表達(dá)的調(diào)控作用;3.應(yīng)用NF-κB特異性抑制劑預(yù)處理后,再用透明質(zhì)酸(hyaluronan HA)處理耐藥誘導(dǎo)模型,檢測(cè)腫瘤細(xì)胞MMP-2MMP-9表達(dá)及侵襲力變化,探討NF-κB特異性抑制劑對(duì)HA誘導(dǎo)的侵襲能力影響。方法:應(yīng)用四唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度阿霉素對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的抑制效應(yīng),從而找到合適的阿霉素濃度進(jìn)行藥物的誘導(dǎo);Quantitative Real-Time聚合酶鏈反應(yīng)(q RT-PCR)及半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)MDR1、NF-κB、CD44st、MMP-2及MMP-9基因表達(dá)水平變化,基因測(cè)序驗(yàn)證CD44st基因;流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry,FCM)細(xì)胞膜P-gp表達(dá)率的變化;羅丹明123(Rho123)潴留實(shí)驗(yàn)檢測(cè)P-gp的功能狀態(tài);Western blotting檢測(cè)CD44,NF-κB蛋白表達(dá)變化;凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)NF-κB/DNA的結(jié)合活性;明膠酶譜分析檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清MMP-2,MMP-9表達(dá)變化;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲力變化。結(jié)果:1.MTT結(jié)果顯示:阿霉素對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50值為0.68±0.04 ug/m;應(yīng)用0.01,0.03,0.06及0.12ug/ml濃度的阿霉素作用MCF-7細(xì)胞7天后,細(xì)胞生長(zhǎng)均受到抑制,與陰性對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);形態(tài)學(xué)觀察,阿霉素在0.03,0.06ug/ml組細(xì)胞,7d后MCF-7細(xì)胞僅出現(xiàn)輕度腫脹,細(xì)胞狀態(tài)尚好,而0.12ug/ml組細(xì)胞狀態(tài)差,明顯腫脹,可見明顯的細(xì)胞碎片。因此,我們選擇阿霉素的誘導(dǎo)終濃度為0.06 ug/ml用于后續(xù)研究。2.q RT-PCR結(jié)果顯示,MCF-7細(xì)胞MDR-1,CD44st及NF-κB基因表達(dá)水平較低,經(jīng)0.010.030.06 ug/ml阿霉素作用后,上述基因表達(dá)水平逐漸增高,并呈劑量依賴性;各處理組細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞比較,及組間兩兩比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);RT-PCR結(jié)果與q RT-PCR結(jié)果相似;基因測(cè)序結(jié)果顯示該CD44st基因序列與此前我們發(fā)現(xiàn)的基因序列(Gene Bank FJ216964)一致。3.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:MCF-7細(xì)胞組與各處理組比較,組間兩兩比較,P-gp表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.Rho123外排實(shí)驗(yàn)顯示:細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度隨P-gp表達(dá)增加而逐漸減少,呈反比關(guān)系(P0.05)。5.Western blotting結(jié)果顯示,CD44及NF-κB蛋白表達(dá)與m RNA表達(dá)變化相一致。6.EMSA檢測(cè)結(jié)果表明,隨著阿霉素用量的增加,NF-кB/DNA的結(jié)合活性呈劑量依賴性增加。7.RT-PCR及明膠酶譜結(jié)果顯示,透明質(zhì)酸(HA)誘導(dǎo)了MCF-7/A 0.06細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9,但這種作用可以被NF-кB特異性抑制劑BMS-345541所阻斷。8.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HA可使MCF-7/A 0.06細(xì)胞侵襲力增強(qiáng),而BMS-345541可阻斷上述作用。結(jié)論:1.采用低劑量逐漸加量法,可成功誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素的多藥耐藥發(fā)生,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)MDR-1,CD44st,NF-κB基因及蛋白表達(dá)逐漸上調(diào),并呈劑量依賴性。2.HA可以通過CD44st的上調(diào),誘導(dǎo)多藥耐藥細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9增加,并影響腫瘤的侵襲力,而這種作用可以被NF-кB特異性抑制劑BMS-345541所阻斷。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of adriamycin on the expression of MDR1 and MMP - 9 in breast cancer cell line MCF - 7 , and to investigate the effect of adriamycin on the expression of MDR1 and MMP - 9 in MCF - 7 cells . The results of RT - PCR and gelatin zymography showed that the expression of MMP - 2 and MMP - 9 in MCF - 7 / A - 0 . 06 cells increased with the increase of P - gp expression .
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 房新建;許文林;張徐;錢暉;陳琛;方莉莉;陳巧云;;人CD44基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)[J];江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年02期

2 弓晉靈;許文林;李娟;楊靖;吳曉君;陳巧云;;一種新CD44變異體(CD44v17)在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J];江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年03期

3 袁蓮香,何偉民,張斌,謝凱圣,唐文瑜;乳腺癌組織MMP-2、MMP-9和TIMP-2蛋白表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后[J];腫瘤;2002年04期

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本文編號(hào)：1924452