本文選題：長鏈非編碼RNA + LncRNA-UCA1�。� 參考：《蘇州大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的:采用高通量測序篩選可能與大腸癌放射敏感性相關(guān)的長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA,LncRNA),研究其對大腸癌細(xì)胞放射敏感性的影響及其機(jī)制。方法:(1)大腸癌輻射抵抗細(xì)胞株CCL244和大腸癌輻射敏感細(xì)胞株HCT116經(jīng)6Gy X射線輻照后,通過lncRNA芯片技術(shù)篩選出X射線照射前后差異表達(dá)的lncRNA。(2)通過實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測lncRNA-UCA1在大腸癌組織及大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)。(3)設(shè)計(jì)合成并篩選出該lncRNA-UCA1最有效的siRNA干擾序列。(4)siRNA轉(zhuǎn)染CCL244細(xì)胞并聯(lián)合6Gy X射線照射處理后,通過噻唑藍(lán)比色法(MTT)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、劃痕實(shí)驗(yàn)及Western Blot實(shí)驗(yàn)分別檢測細(xì)胞活力、增殖能力、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞遷移能力以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3和Bcl-2、遷移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白ZEB1和Vimentin蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)LncRNA芯片測序結(jié)果顯示大腸癌輻射抵抗細(xì)胞株CCL244經(jīng)過X射線照射后lncRNA-UCA1表達(dá)水平升高最為明顯,而輻射敏感細(xì)胞株HCT116經(jīng)照射前后lncRNA-UCA1表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(2)32對臨床組織樣本中,與癌旁組織相比,腫瘤組織中l(wèi)ncRNA-UCA1相對表達(dá)水平為33.24±0.26,P0.001,其中有78.13%的患者lncRNA-UCA1表達(dá)水平相對升高;4對接受新輔助放化療前后的患者臨床樣本中,放療后組織中l(wèi)nc RNA-UCA1相對于放療前呈現(xiàn)高表達(dá);與正常的腸上皮FHC細(xì)胞相比,lncRNA-UCA1在大腸癌HCT116、CCL244、SW480、LOVO細(xì)胞中相對高表達(dá)。(3)三條干擾序列分別轉(zhuǎn)染CCL244細(xì)胞后,使用實(shí)時定量PCR檢測lncRNA-UCA1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)siRNA-2的干擾效果最佳,干擾抑制率為57%(P0.001)。(4)下調(diào)CCL244細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-UCA1表達(dá)聯(lián)合6Gy X射線處理后,與單純照射組相比,細(xì)胞活力明顯下降(P0.001),平均致死劑量(D0)值分別為1.01Gy和1.69Gy,準(zhǔn)閾劑量(Dq)值分別為1.91Gy和2.71Gy,放射增敏比SER為1.67,說明下調(diào)UCA1可以增加CCL244細(xì)胞的放射敏感性;下調(diào)lncRNA-UCA1表達(dá)聯(lián)合6Gy X射線處理后,與單純照射組相比,細(xì)胞凋亡率上升明顯,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)水平上升,Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降,同時G2/M期細(xì)胞比例降低,G2期阻滯情況得以緩解,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);下調(diào)lncRNA-UCA1表達(dá)后,CCL244細(xì)胞的遷移能力受到抑制(16.06±1.30)%vs(35.92±1.63)%,P0.05,遷移相關(guān)蛋白MMP2、MMP9和EMT相關(guān)蛋白ZEB1、Vimentin的表達(dá)水平均降低。結(jié)論:大腸癌輻射抵抗細(xì)胞株CCL244經(jīng)X射線照射前后lncRNA-UCA1差異表達(dá),下調(diào)其表達(dá)可以影響CCL244細(xì)胞的放射敏感性。
[Abstract]:Aim: to study the effects of LncRNAs on radiosensitivity of colorectal cancer cells by high throughput sequencing screening of LncRNAs, which may be related to radiosensitivity of colorectal cancer cells. Methods Radiation-resistant colorectal cancer cell line CCL244 and colorectal cancer radiosensitive cell line HCT116 were irradiated by 6Gy X-rays. LncRNA microarray was used to screen out the differential expression of LNcRNA.t2 before and after X-ray irradiation. The expression of lncRNA-UCA1 in colorectal cancer tissues and colorectal cancer cells was detected by real-time quantitative PCR technique. The lncRNA-UCA1 was designed and synthesized and the most effective siRNA interference sequence was screened out. After transfection of siRNA into CCL244 cells and 6Gy X-ray irradiation, Cell viability, proliferation ability, apoptosis rate and cell cycle distribution were determined by MTT assay, cell cycle, scratch test and Western Blot assay. The expression of apoptosis-related proteins Caspase 3 and Bcl-2, migration associated proteins MMP-2 and MMP-9, and epithelial mesenchymal transformation related proteins ZEB1 and Vimentin were detected. Results the results of DNA sequencing showed that the expression of lncRNA-UCA1 in the radiation-resistant colorectal cancer cell line CCL244 was significantly increased after X-ray irradiation, while the expression of lncRNA-UCA1 in the radiosensitive cell line HCT116 was not significantly different from that in the clinical tissue samples before and after irradiation. Compared with paracancerous tissues, the relative expression level of lncRNA-UCA1 in tumor tissues was 33.24 鹵0.26g / P0.001. 78.13% of the patients had higher lncRNA-UCA1 expression than that of the patients before and after neoadjuvant radiotherapy and chemotherapy, and 78.13% of the patients had increased lncRNA-UCA1 expression in the clinical samples before and after neoadjuvant chemotherapy. Compared with normal intestinal epithelial FHC cells, the expression of lncRNA-UCA1 was detected by real-time quantitative PCR after three interfering sequences were transfected into CCL244 cells, respectively, and compared with those of normal intestinal epithelial FHC cells, and the expression of lncRNA-UCA1 was detected by real-time quantitative PCR after transfection of three interfering sequences into CCL244 cells of colorectal carcinoma HCT116, CCL244, SW480 and LOVO cells, respectively, and compared with normal intestinal epithelial FHC cells, the expression of lncRNA-UCA1 was detected by real-time quantitative PCR after transfection of three interfering sequences into CCL244 cells. It was found that the interference effect of siRNA-2 was the best, and the inhibition rate of interference was 57% (P 0.001N. P0. 4) after down-regulating the expression of lncRNA-UCA1 in CCL244 cells combined with 6Gy X ray treatment, the inhibition rate was higher than that in the control group. The mean lethal dose (D0) was 1.01Gy and 1.69 Gy, the quasi-threshold dose (DQ) was 1.91Gy and 2.71 Gy, the radiosensitization ratio was 1.67, which indicated that down-regulation of UCA1 could increase the radiosensitivity of CCL244 cells, and the down-regulation of lncRNA-UCA1 expression combined with 6Gy X ray treatment could increase the radiosensitivity of CCL244 cells. Compared with the control group, the rate of apoptosis increased significantly, the difference was statistically significant (P 0.001), the expression of apoptosis-related protein (Caspase-3) increased and the expression of Bcl-2 protein decreased, while the arrest of G 2 / M phase was alleviated. After down-regulation of lncRNA-UCA1 expression, the migration ability of CCL244 cells was inhibited by 16.06 鹵1.30)%vs(35.92 鹵1.63% P0.05, and the expression levels of MMP2mMP9 and EMT associated protein ZEB1 + Vimentin were decreased. Conclusion: the differential expression of lncRNA-UCA1 in radiation-resistant colorectal cancer cell line CCL244 before and after X-ray irradiation may affect the radiosensitivity of CCL244 cells.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

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本文編號：1924469