本文選題：肝纖維化 + I型膠原蛋白��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：第一部分膠原蛋白結(jié)合肽CBP1495肝纖維化顯像研究背景:肝纖維化是各種病因引起的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少與纖維組織增多,如果得不到有效控制,將最終發(fā)展為肝硬化,導(dǎo)致肝功能衰竭,甚至機(jī)體死亡。肝纖維化在早期階段是可逆的,而且不同程度的肝纖維化需要不同的治療方案。因此,肝纖維化的早期診斷、定量評價、進(jìn)展監(jiān)測及療效評估對指導(dǎo)肝纖維化治療至關(guān)重要。影像學(xué)檢查是肝纖維化診斷與評估的重要手段,但常規(guī)的超聲、CT和MR等解剖影像難以依據(jù)形態(tài)改變早期診斷肝纖維化。以~(18)F-FDG為代表的現(xiàn)有放射性核素影像雖可用于評估肝纖維化病變的活動性與預(yù)后,但顯示的是肝纖維化造成的代謝異常、組織炎癥等間接征象,不具有特異性。因此,目前還缺少一種理想的、可靠的肝纖維化顯像方式。研制能夠顯示肝纖維化特征性病理改變的新型分子顯像劑可能是解決上述問題的有效途徑。肝纖維化的主要病理特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中膠原蛋白(主要是I型膠原蛋白)的大量堆積,而且I型膠原蛋白堆積量與纖維化的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。因此,I型膠原蛋白是肝纖維化顯像的理想靶標(biāo)�；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)能夠結(jié)合并降解I型膠原蛋白。我們在研究中發(fā)現(xiàn)MMP-2前體中含有MMP-14酶切位點(diǎn)的多肽片段CPKESCNLFVLKD(以下簡稱CBP1495)能夠與I型膠原蛋白以較高的親和力結(jié)合。靶向I型膠原蛋白的多肽分子,因其分子量小,血管與組織穿透性好,血漿清除速度快及低免疫原性等特點(diǎn),適合作為肝纖維化的體內(nèi)示蹤劑。因此,本研究擬進(jìn)一步鑒定CBP1495靶向I型膠原蛋白的能力,并構(gòu)建CBP1495分子探針進(jìn)行大鼠肝纖維化模型顯像研究,為該分子探針用于肝纖維化的診斷與評估奠定理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究方法:1.應(yīng)用等溫滴定量熱法(ITC)分析CBP1495與溶液中的I型膠原蛋白或膠原蛋白模擬肽(GPO)9的親和力,ELISA分析生物素標(biāo)記CBP1495(biotin-CBP1495)與固相包埋的I型膠原蛋白的親和力;2.Western blot及組織學(xué)染色鑒定biotin-CBP1495靶向I型膠原蛋白或膠原纖維的能力;3.制備放射性核素~(99m)Tc標(biāo)記的CBP1495分子探針,并鑒定其標(biāo)記率、體外穩(wěn)定性、血清蛋白結(jié)合率、放化純度(RCP)、油水分配系數(shù)等理化性質(zhì);4.研究~(99m)Tc-CBP1495在健康動物體內(nèi)的示蹤動力學(xué)、動態(tài)與靜態(tài)顯像以及在動物各主要臟器的分布情況;5.以CCl4構(gòu)建大鼠肝纖維化模型并行組織病理學(xué)鑒定,以組織化學(xué)染色鑒定biotin-CBP1495靶向纖維化病變組織的能力;6.以~(99m)Tc-CBP1495為分子探針,行肝纖維化大鼠模型的針孔探頭平面顯像及SPECT/CT斷層融合顯像;7.離體測定大鼠模型肝組織的~(99m)Tc-CBP1495攝取率與代表纖維化程度的羥脯氨酸(Hyp)含量,評價~(99m)Tc-CBP1495的攝取率與Hyp含量的相關(guān)性。研究結(jié)果:1.CBP1495能夠以較高的親和力結(jié)合溶液中的I型膠原蛋白(Kd=6.54μM)或(GPO)9(Kd=0.633μM),以及固相包埋的I型膠原蛋白(Kd=0.861μM);2.Western Blot分析顯示biotin-CBP1495能夠染出I型膠原蛋白4條泳帶中的3條;組織化學(xué)染色結(jié)果表明biotin-CBP1495可以陽性顯示大鼠尾皮膚及小鼠肌腱組織中的膠原纖維;3.制備了標(biāo)記率為95.06±1.08%(n=6)的~(99m)Tc-CBP1495,在室溫下的生理鹽水或37℃人血清中放置8 h后的RCP90%,放置24 h RCP仍85%;~(99m)Tc-CBP1495與血清蛋白均沒有明顯結(jié)合,其油水分配系數(shù)為-3.473±0.014(n=3);4.~(99m)Tc-CBP1495在健康大耳兔(n=6)體內(nèi)的示蹤動力學(xué)過程符合權(quán)重為1/C的三室模型,血液放射性濃度C(k Bq/L)與注射標(biāo)記多肽后的時間t(min)關(guān)系式為:C(t)=1474.001e-0.57t+358.843e-0.028t+92.985e-0.004t;在大耳兔體內(nèi)的靜態(tài)與動態(tài)顯像以及在健康小鼠體內(nèi)的分布實(shí)驗(yàn)顯示:(1)~(99m)Tc-CBP1495通過泌尿系統(tǒng)排泄,不通過肝膽系統(tǒng)排泄;(2)給藥120 min后,~(99m)Tc-CBP1495在血、腦、甲狀腺、心、肝、脾、腎、胃、小腸、肌肉及骨等器官或組織中的分布都穩(wěn)定在低水平,心、肝影像呈稍強(qiáng)于肌肉軟組織本底的淡影;(3)~(99m)Tc-CBP1495在體內(nèi)240 min未解離產(chǎn)生游離~(99m)Tc;5.組織病理學(xué)結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建了大鼠肝纖維化模型,組織化學(xué)染色表明biotin-CBP1495可以陽性顯示肝組織內(nèi)增生的膠原纖維;6.針孔探頭平面顯像示大鼠模型的纖維化肝臟較正常肝臟異常高攝取~(99m)Tc-CBP1495,而SPECT/CT斷層融合顯像進(jìn)一步明確了上述結(jié)果;7.離體定量分析顯示靶與非靶比值(纖維化肝/心)為8.70±2.11(n=6),肝臟對~(99m)Tc-CBP1495的攝取率與肝組織纖維化程度(Hyp含量)呈正比(P0.0001,r2=0.7581)。研究結(jié)論:通過以上研究,我們證實(shí)了CBP1495是一個新型膠原蛋白結(jié)合肽,能夠以較高的親和力結(jié)合I型膠原蛋白或(GPO)9,可體外靶向I型膠原蛋白與膠原纖維。我們成功構(gòu)建了標(biāo)記率與放化純度高、體內(nèi)外穩(wěn)定性好的~(99m)Tc-CBP1495分子探針,該分子探針血漿清除速率快,顯像軟組織本底低,僅從泌尿系統(tǒng)排泄而不經(jīng)肝膽系統(tǒng)排泄,有利于實(shí)施在體分子成像。以~(99m)Tc-CBP1495為探針的SPECT/CT分子成像能夠在體顯示大鼠肝纖維化,并且肝組織攝取~(99m)Tc-CBP1495與肝纖維化程度呈顯著正相關(guān)。因此,~(99m)Tc-CBP1495是一個具有潛在臨床價值的肝纖維化診斷與定量分子顯像劑。第二部分胰腺癌MMP-14活化環(huán)狀CBP1495的初步研究研究背景:精確放療是中晚期胰腺癌患者的重要治療手段,而根據(jù)腫瘤影像進(jìn)行準(zhǔn)確定位與靶區(qū)勾畫是胰腺癌精確放療的基礎(chǔ)。但是CT、MR等常規(guī)影像檢查勾畫的解剖學(xué)靶區(qū)往往小于腫瘤實(shí)際侵犯的生物學(xué)靶區(qū)。以~(18)F-FDG PET為代表的腫瘤代謝顯像,雖能夠?yàn)榫_放療提供癌組織中的高代謝生物靶區(qū),但難以鑒別炎癥等高代謝病灶造成的假陽性。因此,目前用于臨床的影像學(xué)檢查在指導(dǎo)胰腺癌精確放療方面都存在一定局限性,研發(fā)靶向胰腺癌的新型分子顯像探針是解決該問題的有效途徑,而胰腺癌特異靶點(diǎn)的選擇與分子探針的設(shè)計是構(gòu)建胰腺癌新型分子顯像探針的兩個關(guān)鍵因素。不同于其它多數(shù)類型的腫瘤,胰腺癌纖維化是一個普遍現(xiàn)象。因?yàn)镮型膠原蛋白是膠原纖維的主要標(biāo)志分子,所以I型膠原蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)也是顯著增多的,而且I型膠原蛋白具有促進(jìn)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用,其表達(dá)水平越高,發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險越高,患者的預(yù)后也約差。因此,I型膠原蛋白是胰腺癌分子顯像的重要靶點(diǎn)。但是,由于胰腺的慢性炎癥也可能會伴有纖維化病變,所以直接靶向I型膠原蛋白的分子探針會缺乏胰腺癌顯像特異性。胰腺癌組織中的I型膠原蛋白與MMP-14能相互促進(jìn)表達(dá)上調(diào)。在胰腺癌富含膠原蛋白的微環(huán)境中,MMP-14能夠促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。MMP-14在胰腺癌組織中異常高表達(dá),而在正常胰腺組織或胰腺癌旁組織中不表達(dá)或低表達(dá),瘤/非瘤比值高。因此,MMP-14也是胰腺癌分子顯像的靶點(diǎn)。在上一部分的研究中,我們發(fā)現(xiàn)含有MMP-14酶切位點(diǎn)的CBP1495能夠與I型膠原蛋白高親和力結(jié)合,并以~(99m)Tc-CBP1495為分子探針成功在體顯示了大鼠肝或肺纖維化。后續(xù)研究中,為提高CBP1495在體內(nèi)的穩(wěn)定性與血液循環(huán)時間,我們構(gòu)建了首尾酰胺環(huán)化的CBP1495(c CBP1495)。但意外的在ITC分析中發(fā)現(xiàn)c CBP1495與I型膠原蛋白或(GPO)9沒有明顯的結(jié)合能力,而c CBP1495經(jīng)MMP-14酶切的產(chǎn)物c CBP1495-d卻具有與I型膠原蛋白或(GPO)9的結(jié)合能力。根據(jù)以上研究結(jié)果,我們推測c CBP1495可作為一個由MMP-14酶切激活的可活化膠原蛋白結(jié)合肽:當(dāng)喪失了膠原蛋白結(jié)合能力的c CBP1495被胰腺癌高表達(dá)的MMP-14酶切后,形成線狀形態(tài)的c CBP1495-d,繼而恢復(fù)與I型膠原蛋白的結(jié)合能力,然后錨定于胰腺癌組織高表達(dá)的膠原纖維上并逐漸聚集。因?yàn)橐认侔┚哂蠱MP-14與I型膠原蛋白均異常高表達(dá)的特點(diǎn),所以如果成功構(gòu)建出我們設(shè)想的既需要MMP-14活化又繼而靶向I型膠原蛋白的c CBP1495分子探針,則有望實(shí)現(xiàn)高靶/非靶比值的胰腺癌特異性分子顯像。基于上述分析,我們擬進(jìn)一步明確胰腺癌MMP-14表達(dá)情況及其臨床價值,然后比較c CBP1495及其MMP-14酶切產(chǎn)物c CBP1495-d靶向I型膠原蛋白的能力,在體外初步評價MMP-14和高表達(dá)MMP-14的胰腺癌細(xì)胞對c CBP1495的活化作用,為下一步構(gòu)建c CBP1495分子探針并進(jìn)行胰腺癌體內(nèi)顯像研究提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法:1.免疫組化染色分析68對人胰腺癌組織及癌旁組織MMP-14的表達(dá)情況;Western blot檢測8對人胰腺癌與癌旁組織,以及胰腺癌細(xì)胞株Bxpc-3與正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株HPDE的MMP-14表達(dá)水平,并半定量分析瘤/非瘤比值;2.收集了上述68位胰腺癌患者的臨床病理資料,分析MMP-14的表達(dá)水平(免疫組化結(jié)果評分)與胰腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系;3.ITC分析biotin-c CBP1495和biotin-c CBP1495-d與溶液中的I型膠原蛋白或膠原蛋白模擬肽(GPO)9的親和力,ELISA分析biotin-c CBP1495和biotin-c CBP1495-d與固相包埋的I型膠原蛋白的親和力;4.Western blot及組織學(xué)染色比較biotin-c CBP1495和biotin-c CBP1495-d靶向I型膠原蛋白或膠原纖維的能力;5.高效液相色譜偶聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS)鑒定MMP-14酶切biotin-CBP1495的活性;6.ELISA實(shí)驗(yàn)評價MMP-14和高表達(dá)MMP-14的胰腺癌細(xì)胞株Bxpc-3對biotin-c CBP1495的活化作用。研究結(jié)果:1.免疫組化分析顯示胰腺癌的MMP-14表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P0.0001);Western blot分析顯示胰腺癌與癌旁組織的MMP-14表達(dá)水平比值高(4.54~29.31,14.13±7.45,n=8);MMP-14在Bxpc-3中呈高表達(dá),而在HPDE中微弱表達(dá),兩者具有顯著差異(P=0.0013);2.胰腺癌的MMP-14表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移(包括淋巴結(jié)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,P=0.013)、TNM分期(P=0.021)及患者預(yù)后密切相關(guān)(P=0.034);3.biotin-c CBP1495不能結(jié)合I型膠原蛋白;biotin-c CBP1495-d能夠結(jié)合溶液中的I型膠原蛋白(Kd=31.5μM)或(GPO)9(Kd=2.00μM)以及固相包埋的I型膠原蛋白(Kd=5.797μM)。4.Western Blot與組織化學(xué)染色顯示biotin-c CBP1495的結(jié)果均為陰性,biotin-c CBP1495-d能夠染出I型膠原蛋白4條泳帶中的2條,并且能夠陽性顯示正�；蚶w維化大鼠肺組織中的膠原纖維,但染色強(qiáng)度較biotin-CBP1495弱;5.HPLC-MS分析顯示biotin-CBP1495能夠在體外被MMP-14有效酶切;6.ELISA分析顯示,在體外與MMP-14或高表達(dá)MMP-14的胰腺癌細(xì)胞Bxpc-3作用2小時后,部分biotin-c CBP1495發(fā)生活化,顯示出與I型膠原蛋白的結(jié)合能力;研究結(jié)論:通過以上研究,我們證實(shí)了MMP-14在胰腺癌中異常高表達(dá),瘤/非瘤比值高。MMP-14的表達(dá)水平與胰腺癌的轉(zhuǎn)移、分期密切相關(guān),MMP-14高表達(dá)是胰腺癌的不良預(yù)后因素。因此MMP-14是胰腺癌分子顯像的理想靶標(biāo)。進(jìn)一步研究顯示呈首尾酰胺環(huán)化的c CBP1495不能結(jié)合I型膠原蛋白,但能被胰腺癌高表達(dá)的MMP-14酶切后形成線性的c CBP1495-d,并部分恢復(fù)靶向I型膠原蛋白或膠原纖維的功能。因此,我們的研究初步證明c CBP1495能夠在體外被胰腺癌細(xì)胞高表達(dá)的MMP-14酶切活化為具有I型膠原蛋白靶向功能的c CBP1495-d,為進(jìn)一步構(gòu)建c CBP1495分子探針及其胰腺癌活體成像研究奠定了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575.2;R735.9

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本文編號：1922627