本文選題：衣霉素 + 紫杉醇�。� 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一,其中約有15-20%的乳腺癌患者屬于三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)。三陰性乳腺癌由于缺乏受體表達,目前尚未發(fā)現(xiàn)其特異性的治療指征,因此是惡性程度及復(fù)發(fā)率最高、轉(zhuǎn)移最快、預(yù)后最差的女性惡性腫瘤。有研究表明PI3K/AKT信號通路在調(diào)控腫瘤細胞增殖、分化、運動和代謝中發(fā)揮著重要作用,而絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases,MAPKs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細胞增殖和凋亡有密切關(guān)系。PI3K/AKT信號通路和MAPK信號通路的異�；罨鹆� TNBC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。紫杉醇是一種廣泛應(yīng)用于多種腫瘤治療的細胞毒類藥物。紫杉醇可以通過抑制微管解聚將細胞周期阻礙在G2/M期,進而引發(fā)細胞凋亡。然而,有文獻報道紫杉醇可以引起PI3K/AKT信號通路和MAPK信號通路的激活進而使腫瘤細胞對紫杉醇產(chǎn)生耐藥性。衣霉素作為一種蛋白質(zhì)N-糖基化抑制劑不僅可以抑制腫瘤生長,還具有降低藥物抗性的作用。研究發(fā)現(xiàn),衣霉素不僅通過降低P糖蛋白(Pgp)的糖基化水平降低Pgp功能,而且可以抑制PI3K/AKT和MAPK通路的激活,從而增強乳腺癌細胞對藥物的敏感性,促進細胞凋亡。本課題選用三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞株,對衣霉素和紫杉醇單獨或聯(lián)合用藥的細胞增殖抑制作用進行評價,通過軟件處理計算兩種藥物的相互作用指數(shù),確定藥物之間的作用方式。然后對衣霉素和紫杉醇聯(lián)合用藥的增效作用機制進行探討,首先在細胞水平上研究衣霉素是否會促進紫杉醇誘導(dǎo)的細胞凋亡,并對于紫杉醇引起的周期阻滯及微管蛋白聚合的影響進行研究,之后探討衣霉素對紫杉醇引起的PI3K/AKT和MAPK信號通路異常激活的影響。在體外水平上進行初步研究后,為了證實體外實驗結(jié)論的可靠性,我們構(gòu)建了表達綠色熒光蛋白(GFP)的MDA-MB-2311/GFP荷瘤裸鼠模型,在復(fù)雜的機體環(huán)境中研究衣霉素和紫杉醇單獨或聯(lián)合用藥對于腫瘤生長的抑制作用,并對聯(lián)合用藥的抗腫瘤作用機制進行研究。本論文取得的研究結(jié)果如下:1.在MDA-MB-231細胞中,衣霉素與紫杉醇對細胞增殖抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)。采用SRB法檢測衣霉素和紫杉醇單獨或聯(lián)合用藥后MDA-MB-231細胞的數(shù)量變化發(fā)現(xiàn),衣霉素或紫杉醇單獨給藥,對細胞增殖的抑制作用均存在濃度依賴性關(guān)系。其中衣霉素的IC50值是4.68±0.25 μg/ml,紫杉醇的IC50值是0.28±0.10μg/ml。不同濃度紫杉醇與衣霉素聯(lián)合用藥組相互作用指數(shù)均小于1,說明兩種藥物聯(lián)合用藥對于MDA-MB-231細胞的增殖抑制存在協(xié)同作用。2.衣霉素促進了紫杉醇誘導(dǎo)的細胞凋亡。Annexin V-FITC/PI凋亡檢測實驗結(jié)果顯示,衣霉素單獨給藥會造成6%的腫瘤細胞發(fā)生早期凋亡,10.7%的細胞發(fā)生晚期凋亡;紫杉醇給藥會誘發(fā)7.5%的早期凋亡和20%的晚期凋亡。與單獨用藥相比,衣霉素和紫杉醇聯(lián)合用藥可以顯著性提高凋亡細胞(包括22.8%的早期凋亡細胞和22.1%的晚期凋亡細胞)所占比例。通過對MDA-MB-231進行細胞核染色后形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),衣霉素給藥后會造成細胞核質(zhì)固縮,證實衣霉素的促凋亡活性。3.在MDA-MB-231細胞中,衣霉素沒有改變紫杉醇誘導(dǎo)的細胞周期阻滯,但改變了微管蛋白的聚合。流式細胞儀測定結(jié)果表明,衣霉素會造成腫瘤細胞G0/G1期阻滯,而紫杉醇可以將細胞周期阻滯在G2/M期。與紫杉醇單獨用藥相比,1.0 μg/ml衣霉素與0.1 μg/ml紫杉醇聯(lián)合用藥對于細胞周期分布并沒有表現(xiàn)出顯著性改變,可見衣霉素對于紫杉醇引起的細胞周期阻滯作用基本無影響。微管蛋白聚合免疫熒光實驗證實,衣霉素會降低紫杉醇造成的微管蛋白聚合。通過蛋白免疫印跡實驗也進一步表明,衣霉素引起可溶性α-tubulin單體增加,不溶性α-tubulin聚合體降低,也即聯(lián)合用藥導(dǎo)致聚合的微管蛋白數(shù)量減少。因此,衣霉素沒有改變紫杉醇誘導(dǎo)的細胞周期阻滯,但改變了微管蛋白的聚合。4.在MDA-MB-231細胞中,衣霉素降低了紫杉醇誘導(dǎo)的PI3K/AKT和MAPK信號通路的異常激活。衣霉素對于腫瘤細胞中AKT、ERK、JNK和p38磷酸化的抑制作用存在劑量依賴性。紫杉醇單獨用藥可以誘導(dǎo)PI3K/AKT和MAPK信號通路的異�；罨Ｅc紫杉醇單獨給藥相比,衣霉素和紫杉醇聯(lián)合用藥后可以降低PI3K/AKT和MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的表達水平和磷酸化水平。5.在荷瘤裸鼠試驗中,衣霉素提高了紫杉醇對腫瘤生長的抑制作用。通過對于帶有GFP標(biāo)簽的MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)移瘤的觀察發(fā)現(xiàn),對照組、衣霉素組、紫杉醇組和聯(lián)合用藥組熒光強度分別為1.57×l010p/s、1.16×1010p/s、7.24× 109 p/s和3.92× 109 p/s。與對照組相比較,三個給藥組的熒光總通量均顯著性降低;與紫杉醇或者衣霉素單獨給藥組相比較,聯(lián)合用藥組的熒光總通量顯著性降低。腫瘤體積變化檢測結(jié)果表明,與對照組相比,衣霉素組、紫杉醇組和聯(lián)合用藥組對于移植瘤生長的抑制率分別為21.1%、77.1%和92.9%。聯(lián)合用藥組與兩種藥物的單獨用藥組相比存在顯著性差異,抑制腫瘤生長效果明顯好于兩者單獨用藥。Ki67組織免疫化學(xué)染色實驗結(jié)果顯示,對照組、衣霉素組、紫杉醇組和聯(lián)合用藥組Ki67陽性細胞所占比例分別為30.9%、19.9%、15.7%和8.6%。這表明對照組增殖能力強于其他3組藥物組,聯(lián)合用藥組對細胞增殖抑制作用強于兩種藥物單獨用藥。采用TUNEL法檢測腫瘤組織中的細胞凋亡,結(jié)果顯示紫杉醇單.獨用藥腫瘤組織中凋亡細胞占比10.2%,而聯(lián)合給藥組中裸鼠腫瘤組織中凋亡細胞占比增加至28.9%,表明衣霉素的加入可以增強紫杉醇引起的細胞凋亡。6.在荷瘤裸鼠的腫瘤組織中,衣霉素降低了紫杉醇誘導(dǎo)的PI3K/AKT和MAPK信號通路的異常激活,增強了腫瘤細胞促凋亡相關(guān)蛋白的活化。與體外實驗結(jié)果相似,在動物水平上檢測聯(lián)合用藥對于腫瘤細胞中AKT、ERK、JNK和p38蛋白表達和磷酸化水平的影響發(fā)現(xiàn),衣霉素可以顯著性降低這些PI3K/AKT和MAPK信號通路相關(guān)蛋白的本底表達和活化。通過對于凋亡相關(guān)蛋白caspase3和PARP的表達進行檢測表明聯(lián)合用藥具有更好的促凋亡作用。綜上所述,通過本課題研究,我們在細胞和動物水平上,初步評價了衣霉素和紫杉醇聯(lián)合用藥治療三陰性乳腺癌的可行性,證明了兩種藥物之間存在協(xié)同作用。對聯(lián)合用藥增效機制的研究發(fā)現(xiàn),衣霉素降低了紫杉醇引起的PI3K/AKT和MAPK信號通路異�；罨�,增強了 MDA-MB-231細胞對紫杉醇的敏感性,并增強下游促凋亡相關(guān)蛋白的活性,最終導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡。
[Abstract]:Breast cancer is one of the most common malignant tumors in women , among which about 15 - 20 % of patients with breast cancer belong to triple negative breast cancer ( TNBC ) . In order to study the effect of adriamycin and paclitaxel on the proliferation , differentiation , movement and metabolism of tumor cells , it is found that it can inhibit the proliferation , differentiation , movement and metabolism of tumor cells . Compared with the control group , the dose - dependent inhibition rate of paclitaxel - induced cell cycle arrest was significantly lower than that of control group . In conclusion , through the study of apoptosis - related proteins caspase3 and parp , we preliminarily evaluated the feasibility of combination therapy for triple - negative breast cancer .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

【參考文獻】

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1 吳婧;王寧菊;馬吉光;;三陰性乳腺癌組織中MAPK蛋白的表達及臨床意義[J];寧夏醫(yī)學(xué)雜志;2015年02期

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本文編號：1898717