本文選題：miR-196a基因 + 靶基因��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：食管癌是世界常見惡性腫瘤之一,每年新增病例約40萬~50萬例,其中大約50%左右的病例發(fā)生在中國。河北省磁縣是中國的食管癌高發(fā)區(qū),食管癌的患病率與死亡率居全省惡性腫瘤的首位,嚴(yán)重威脅人類的健康。顯著的地域性分布差異(高、低發(fā)區(qū)發(fā)病率相差500倍)和家族聚集性現(xiàn)象是高發(fā)區(qū)食管癌的流行病學(xué)特征。提示環(huán)境因素和遺傳因素可能均在食管癌發(fā)生過程中起重要作用。MicroRNAs(mi RNAs)是一類高度保守的、大約有23個(gè)核苷酸的、內(nèi)源性非編碼小分子RNA,廣泛存在于人類及其它真核生物體內(nèi)。mi RNAs可作為癌基因或抑癌基因,通過與其靶基因、上游轉(zhuǎn)錄因子及各種反饋調(diào)控回路等相互交織組成復(fù)雜的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò),參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,為腫瘤的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)mi R-196與多種腫瘤發(fā)生及預(yù)后相關(guān),以癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用。miR-196在食管癌中高表達(dá),表明它作為癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。存在于mi R-196a-2基因上的T/C多態(tài)(rs11614913),能夠引起pre-miR196a2莖區(qū)G:C到G:T的改變,可能會(huì)影響pre-miR-196a-2變成成熟體的過程或影響該miRNA的靶點(diǎn)識(shí)別,并且具有組織特異性。同時(shí),mi R196a2作為一個(gè)內(nèi)源性mi RNA基因,擁有自己的啟動(dòng)子區(qū)。存在于mi R-196a-2基因啟動(dòng)子區(qū)的功能性多態(tài)rs35010275有可能影響基因的表達(dá)水平,攜帶GG基因型能夠上調(diào)胃癌患者的癌組織或者癌旁正常組織的mi R-196a-2的表達(dá)水平。mi R-196a的候選靶基因包括HOX家族,HMGA2,ANXA1和p27kip1等。研究發(fā)現(xiàn),miR-196可通過抑制HOXB8的蛋白表達(dá),促進(jìn)HL60細(xì)胞向髓細(xì)胞分化;通過下調(diào)p27kip1的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞的增殖;另外,細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn),miR-196a表達(dá)水平增高能夠?qū)е翧NXA1表達(dá)下調(diào),而ANXA1表達(dá)的抑制或缺失與食管癌的發(fā)生有關(guān)。本研究首先應(yīng)用PCR-LDR技術(shù)檢測并探討mi R-196a-2基因rs11614913t/c多態(tài)、rs35010275g/c多態(tài)與中國食管癌高發(fā)區(qū)磁縣人群食管癌發(fā)生和預(yù)后的關(guān)系;其次,采用qrt-pcr技術(shù)檢測了mir-196a基因及其靶基因anxa1、p27kip1、hoxc8和hoxb8在食管癌組織、癌旁組織和正常黏膜組織中的表達(dá)情況。深入分析了mir-196a基因及其靶基因表達(dá)水平之間的關(guān)系。再次,進(jìn)行mir-196a基因的過表達(dá)或抑制,并通過mtt實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)研究mir-196a對食管癌細(xì)胞株eca109細(xì)胞和kyse30細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。第一部分mir-196a-2基因多態(tài)性與escc遺傳易感性及預(yù)后的關(guān)聯(lián)研究目的:探討mir-196a-2基因rs11614913c/tsnp和rs35010275c/gsnp與食管癌高發(fā)區(qū)磁縣人群escc遺傳易感性及預(yù)后的關(guān)系,以尋找高發(fā)區(qū)人群escc發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)志物。方法:本研究共包括597例食管癌患者和597名健康對照個(gè)體。食管癌患者是2006年~2012年在磁縣經(jīng)內(nèi)鏡普查、并經(jīng)當(dāng)?shù)蒯t(yī)院組織學(xué)檢查確診為食管鱗狀細(xì)胞癌的門診或住院病人。健康對照為同時(shí)間、同地區(qū)內(nèi)鏡普查無上消化道腫瘤的正常無關(guān)個(gè)體。調(diào)查并記錄escc患者及健康對照個(gè)體的年齡、性別、吸煙狀況及家族史等情況。將性別、年齡等與食管癌發(fā)生有關(guān)的影響因素作為匹配條件,最終選取597名健康個(gè)體作為對照。吸煙或者曾吸煙每日5支及以上,并持續(xù)至少兩年者定義為吸煙個(gè)體。至少1名一級(jí)親屬和/或至少2名二級(jí)親屬患食管癌/賁門癌/胃癌的個(gè)體,則定義為具有上消化道腫瘤(uppergastrointestinalcancers,ugic)家族史。采用pcr-ldr方法對mir-196a-2基因rs11614913c/tsnp和rs35010275c/gsnp進(jìn)行基因分型。結(jié)果:1escc患者組ugic家族史陽性個(gè)體比例為47.6%,顯著高于健康對照組(38.4%)(χ2=10.34,p0.01),表明ugic家族史可顯著增加escc的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),經(jīng)性別、年齡校正后的or值為1.46(95%ci=1.16~1.84)。2在健康對照組中mir-196a-2基因rs11614913c/tsnp基因型分布符合hardy-weinberg平衡(χ2=0.001,p=0.97)。escc患者組的cc、ct、tt基因型頻率分別為21.5%、51.4%、27.1%,與健康對照組的基因型頻率(24.3%、49.9%、25.8%)相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.40,p=0.50)。與cc基因型相比,攜帶ct、tt、ct/tt基因型均未增加escc的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),校正后的or值分別為1.17(95%ci=0.88~1.56)、1.20(95%ci=0.86~1.66)和1.18(95%ci=0.90~1.55)。分層分析顯示,與cc基因型相比,攜帶tt/ct基因型可能增加≤60歲的個(gè)體escc的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(or=1.56,95%ci,1.08~2.26),但未能增加60歲個(gè)體escc的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(or=0.82,95%ci,0.55~1.23)�；�-年齡之間的交互作用發(fā)現(xiàn),mir-196a-2基因rs11614913c/tsnp與年齡之間存在交互作用,表明患者發(fā)病年齡越早,遺傳傾向在其中的作用就越大。3mir-196a-2基因啟動(dòng)子區(qū)rs35010275g/csnp基因型分布在健康對照組中符合hardy-weinberg平衡(χ2=0.04,p=0.83)。健康對照組及escc患者組的gg、gc、cc基因型頻率分別為49.1%、42.2%、8.7%和52.9%、40.9%、6.2%。rs35010275多態(tài)的基因型頻率總體分布在健康對照組及escc患者組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與gg基因型相比,攜帶gc、cc、gc/cc基因型未改變escc的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),校正后or值分別為0.90(95%ci=0.71-1.14)、0.67(95%ci=0.42~1.05)和0.86(95%ci=0.68~1.08)。分層分析發(fā)現(xiàn),與gg基因型或gc/gg基因型相比,攜帶cc基因型能夠降低≤60歲的個(gè)體escc的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),or值分別為0.49(95%ci=0.26-0.92)和0.51(0.28-0.93)。4未發(fā)現(xiàn)mir-196a-2基因的rs11614913多態(tài)與rs35010275多態(tài)與escc的預(yù)后的關(guān)系。結(jié)論:1mir196a2基因rs11614913c/tsnp的t等位基因能夠增加≤60歲年齡組人群escc的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。2mir196a2基因啟動(dòng)子區(qū)的rs35010275多態(tài)的c等位基因是≤60歲年齡組人群escc的發(fā)病的保護(hù)因素。第二部分mir-196a及其靶基因在食管癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析目的:通過檢測mir-196a基因及anxa1、p27kip1、hoxc8和hoxb8等靶基因在食管癌組織、癌旁組織和正常黏膜組織中的表達(dá)情況,以及分析mir-196a與候選靶基因之間的相關(guān)性,探討mir-196a基因及其靶基因在食管癌發(fā)生過程可能發(fā)揮的作用。方法:收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科2012年9月至2013年3月食管癌根治性手術(shù)切除標(biāo)本28例。采用qrt-pcr技術(shù)檢測mir-196a基因及其靶基因anxa1、p27kip1、hoxc8和hoxb8在食管癌組織、癌旁組織和正常黏膜組織中的表達(dá)。另外,分析了mir-196a表達(dá)與候選靶基因anxa1、p27kip1、hoxc8和hoxb8表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果:1mir-196a在癌旁組織和癌組織中的表達(dá)上調(diào)率分別是64.29%(18/28)和100%(28/28)。mir-196a在正常黏膜組織、癌旁組織和癌組織中的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=42.07,p0.001)。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn),癌組織中mir-196a的表達(dá)水平顯著高于正常黏膜組織和癌旁組織。2靶基因anxa1,p27kip1和hoxb8的表達(dá)水平在正常黏膜組織、癌旁組織和癌組織中的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均0.001)。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn),癌組織中anxa1,p27kip1和hoxb8的表達(dá)水平顯著低于正常黏膜組織和癌旁組織。hoxc8的表達(dá)水平在正常黏膜組織、癌旁組織和癌組織中的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.29,p=0.87)。3mir-196a及其候選靶基因anxa1和p27kip1、hoxc8和hoxb8的正常黏膜組織和癌旁組織間、正常黏膜組織和癌組織之間、癌旁組織與癌組織之間的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.80,p0.001)。4mir-196a與候選靶基因anxa1、p27kip1和hoxb8之間的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(p值均0.001),anxa1、p27kip1和hoxb8的表達(dá)水平隨mir-196a的表達(dá)升高而下降。結(jié)論:1mir-196a在食管癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織和正常黏膜組織;候選靶基因hoxb8、p27kip1和anxa1的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織和正常黏膜組織;hoxc8的表達(dá)水平與escc的發(fā)生無關(guān)。2mir-196a的表達(dá)水平與候選靶基因hoxc8、hoxb8、p27kip1和anxa1的表達(dá)水平之間存在顯著負(fù)相關(guān),表明mir-196a可能通過抑制靶基因anxa1、hoxb8和p27kip1的表達(dá)而發(fā)揮癌基因的作用。第三部分mir-196a對食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為及靶基因表達(dá)水平的影響目的:探討mir-196a在食管癌中的功能及其發(fā)揮功能的機(jī)制。方法:轉(zhuǎn)染mir-196amimic或mir-196ainhibitor及negativecontrol,通過qrt-pcr的方法檢測mir-196a及其靶基因anxa1、p27kip1、hoxc8和hoxb8的表達(dá)水平,對組織學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;并通過mmt實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)研究mir-196a對食管癌細(xì)胞株eca109和kyse30增殖、遷移和侵襲的影響。結(jié)果:1人食管癌細(xì)胞株eca109轉(zhuǎn)染mir-196amimic或inhibitor后,mir-196amimic轉(zhuǎn)染組中mir-196a的表達(dá)水平較陰性對照組顯著增高(約14.45倍,p0.01);mir-196ainhibitor轉(zhuǎn)染組中mir-196a的表達(dá)水平較陰性對照組顯著降低(降低約29%,p0.01)。靶基因anxa1、p27kip1、hoxc8和hoxb8的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2人食管癌細(xì)胞株kyse30轉(zhuǎn)染mir-196amimic或inhibitor后,mir-196amimic轉(zhuǎn)染組中mir-196a的表達(dá)水平較陰性對照組顯著增高(約55.48倍,p0.01),靶基因hoxb8的表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;mir-196ainhibitor轉(zhuǎn)染組中mir-196a的表達(dá)水平較陰性對照組顯著降低(降低約31%,p=0.04),hoxb8的表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3mtt細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h和96h后,mir-196amimic組相對于陰性對照組的細(xì)胞存活率為:100%,103%,112%,117%和111%,過表達(dá)組與陰性對照組相比,細(xì)胞增殖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(f=5952.77,p0.001);eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h和96h后,mir-196ainhibitor組相對于陰性對照組的細(xì)胞存活率為:99%,87%,91%,87%和87%,兩組之間細(xì)胞增殖的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(f=6622.80,p0.001)。對人食管癌細(xì)胞株kyse30的作用與eca109細(xì)胞相同。4對人食管癌細(xì)胞株eca109和kyse30的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,mir-196amimic轉(zhuǎn)染組24h后劃痕愈合比例增加,mir-196ainhibitor轉(zhuǎn)染組劃痕愈合比例降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,mir-196amimic轉(zhuǎn)染組24h后每個(gè)視野下穿過細(xì)胞數(shù)增加,mir-196ainhibitor轉(zhuǎn)染組穿過細(xì)胞數(shù)減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1人食管癌細(xì)胞株Eca109轉(zhuǎn)染miR-196a mimic后,miR-196a的表達(dá)上調(diào);轉(zhuǎn)染miR-196a inhibitor后,mi R-196a的表達(dá)下調(diào);未見其靶基因ANXA1、p27kip1、HOXC8和HOXB8的異常表達(dá)。2人食管癌細(xì)胞株KYSE30轉(zhuǎn)染mi R-196a mimic后,mi R-196a的表達(dá)水平顯著升高,其靶基因HOXB8的表達(dá)下降;轉(zhuǎn)染miR-196a inhibitor后,mi R-196a的表達(dá)水平顯著下降,其靶基因HOXB8的表達(dá)升高。3 MTT實(shí)驗(yàn)顯示,過表達(dá)或抑制miR-196a后,均可促進(jìn)或抑制人食管癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞和KYSE30細(xì)胞的增殖。4 Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,過表達(dá)或抑制mi R-196a對人食管癌細(xì)胞株Eca109和KYSE30細(xì)胞的遷移、侵襲能力有顯著影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：1890614