本文選題：缺氧 + 靶向治療��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分缺氧對腎癌786-O細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響目的:探討缺氧條件下培養(yǎng)的腎癌786-O細(xì)胞在增殖能力、凋亡能力以及遷移能力和侵襲能力等方面有無明顯變化;方法:采用含雙抗(青霉素和鏈霉素)、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)腎癌786-O細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng),缺氧條件為37℃,5%CO2,2%O2,93%N2,細(xì)胞8小時(shí)、12小時(shí)以及24小時(shí)后進(jìn)行增殖、凋亡、遷移和侵襲檢測。對照組為常氧條件下(37℃,5%CO2,O2 95%)培養(yǎng)的腎癌786-O細(xì)胞。采用MTT比色法檢測腎癌786-O細(xì)胞的增殖的變化;采用Hoechst染色法,熒光鏡下取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化;采用Transwell小室,檢測細(xì)胞遷移能力的變化;采用Matrigel包被的Transwell小室,檢測細(xì)胞侵襲能力的變化,結(jié)果采用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析,P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.MTT比色法:腎癌786-O細(xì)胞培養(yǎng)8小時(shí)、12小時(shí)以及24小時(shí)后,腎癌786-O細(xì)胞的增殖分別為(缺氧v.s常氧):97.6±3.6 v.s 96.5±4.2(8h);95.4±2.5 v.s 96.7±2.5(12h);98.1±2.3 v.s 97.3±2.6(24h)。結(jié)果顯示在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn),缺氧對腎癌786-O細(xì)胞的增殖并無明顯影響(P0.05)。2.Hoechst染色結(jié)果:腎癌786-O細(xì)胞培養(yǎng)8小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)后,凋亡計(jì)數(shù)分別為(缺氧v.s常氧):17.2±3.2 v.s 28.2±2.4(8h);18.4±1.9 v.s 26.7±2.2(12h);17.4±2.3 v.s 26.9±2.8(24h),統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn),缺氧處理的腎癌786-O細(xì)胞凋亡受到抑制(P0.05)。3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果:腎癌786-O細(xì)胞培養(yǎng)8小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)后,細(xì)胞凋亡率(%)分別為(缺氧v.s常氧):5.2±1.2 v.s 11.2±1.9(8h);6.7±1.1 v.s 9.7±1.2(12h);6.5±0.9 v.s 9.9±1.6(24h),統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn),缺氧條件下培養(yǎng)的腎癌786-O細(xì)胞凋亡率減少(P0.05)。4.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:培養(yǎng)腎癌786-O細(xì)胞至8小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí),計(jì)數(shù)細(xì)胞結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組和對照組腎癌786-O細(xì)胞遷移數(shù)分別為(缺氧v.s常氧)96±7.4 v.s 65±6.7(8h);156±8.4 v.s 94±8.4(12h);320±16.2 v.s 215±12.3(24h)。在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn),缺氧組細(xì)胞遷移數(shù)目較常氧組明顯增多(P0.05)。5.侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:培養(yǎng)腎癌786-O細(xì)胞至8小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí),結(jié)果顯示侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(缺氧v.s常氧):46±3.4 v.s22±2.7(8h);86±2.4 v.s 51±3.1(12h);226±16.2 v.s 176±11.9(24h)。統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn),缺氧組侵襲細(xì)胞數(shù)目較常氧組明顯增多(P0.05)。因缺氧條件下細(xì)胞培養(yǎng)至24h時(shí),檢測腎癌786-O細(xì)胞侵襲和遷移時(shí)候現(xiàn),穿過室膜數(shù)目過多,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)的缺氧時(shí)間控制為12h。結(jié)論:1.缺氧(37℃,5%CO2,O2 95%)對腎癌786-O細(xì)胞增殖能力無明顯影響;2.缺氧(37℃,5%CO2,O2 95%)能夠顯著增加腎癌786-O細(xì)胞的抗凋亡能力;3.缺氧(37℃,5%CO2,O2 95%)能夠明顯促進(jìn)腎癌786-O細(xì)胞的遷移能力;4.缺氧(37℃,5%CO2,O2 95%)能夠明顯促進(jìn)腎癌786-O細(xì)胞的侵襲能力。第二部分缺氧和NS398對腎癌786-O細(xì)胞內(nèi)HIF 2α、COX2、E-cadherin/Snail蛋白表達(dá)的影響目的:探討缺氧對腎癌786-O細(xì)胞內(nèi)與缺氧和侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)水平的變化,檢測環(huán)氧合酶特異性抑制劑NS398對腎癌786-O缺氧細(xì)胞內(nèi)缺氧和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)以及細(xì)胞侵襲能力的影響。方法:1.購買銳博公司合成的si-RNA-HIF 1α、si-RNA-HIF 2α,序列如下:HIF 1α正義鏈序列(5’-3’):GGGUAAAGAACAAAACACA;反義鏈序列:UGUGUUUUGUUCUUUACCC(si RNA ID#42840);HIF 2α正義鏈序列:(5’-3’)GGUUUUGUUGCUAGCCCUU;反義鏈序列:AAGGGCUAGCAACAAAACC(si RNA ID no.106447),按照說明書將si-RNA-HIFs和Lipofectamine TM 2000混合,采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法,將20n M、50n M、100n M濃度的si-RNA-HIF1α/2α轉(zhuǎn)入腎癌786-O細(xì)胞內(nèi),48小時(shí)后檢測熒光鏡下檢測轉(zhuǎn)染成功的活細(xì)胞比例,計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。2.將轉(zhuǎn)染了si-RNA-HIF1α和si-RNA-HIF2α的腎癌786-O細(xì)胞進(jìn)行缺氧培養(yǎng)和常氧培養(yǎng),對照組為未轉(zhuǎn)染si-RNA的腎癌786-O細(xì)胞。采用Western blotting檢測細(xì)胞內(nèi)HIF 1α、HIF 2α蛋白的表達(dá);將轉(zhuǎn)染后的腎癌786-O細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)3h、8h、12h、24h,Transwell檢測侵襲能力的變化,對照組為未轉(zhuǎn)染si-RNA的腎癌786-O細(xì)胞;3.將腎癌786-O細(xì)胞分2組:缺氧+si-RNA-HIF 1α組,缺氧+si-RNA-HIF 2α組。缺氧條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞12h,采用Westernblotting檢測腎癌786-O細(xì)胞內(nèi)COX2、E-cadherin/Snail蛋白的表達(dá);4.常氧條件下,將20u M、40 u M、80 u M終濃度的NS398分別與腎癌786-O細(xì)胞共培養(yǎng)12h、24h、36h,采用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖活性的變化,對照組不加NS398(0 u M),篩選NS398對腎癌786-O細(xì)胞的無細(xì)胞毒性作用的濃度;5.將腎癌786-O細(xì)胞分成4組,常氧組,缺氧組,常氧+NS398組,缺氧+NS398組,培養(yǎng)時(shí)間為12h。環(huán)氧合酶特異性抑制劑NS398濃度為40u M。采用Transwell檢測腎癌786-O細(xì)胞的侵襲能力的變化,Western blotting檢測腎癌786-O細(xì)胞內(nèi)HIF 2α、COX2、E-cadherin/Snail蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.熒光鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)后計(jì)算轉(zhuǎn)染率,結(jié)果顯示(%):si-RNA-HIF1α20n M 15±3.6;50n M 46±3.2;100n M 74±8.9。si-RNA-HIF 2α20n M 14.1±2.1;50n M 36.2±5.3;100n M 66±7.4。上述結(jié)果顯示,運(yùn)用100n M si-RNA-HIFs能夠成功轉(zhuǎn)染腎癌786-O細(xì)胞。2.Western blot檢測結(jié)果顯示:腎癌786-O細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)結(jié)果為(缺氧v.s常氧):HIF1α0.61±0.08 v.s 0.14±0.04;HIF2α0.63±0.13,單因素方差分析結(jié)果顯示:P=0.010.05,缺氧誘導(dǎo)腎癌786-O細(xì)胞內(nèi)HIF1α和HIF2α表達(dá)升高。但是,當(dāng)轉(zhuǎn)染si-RNA-HIF后,無論缺氧還是常氧條件下培養(yǎng)的腎癌786-O細(xì)胞內(nèi)均未能檢測到與si-RNA相應(yīng)的靶蛋白的表達(dá),進(jìn)一步說明轉(zhuǎn)染成功;侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:將si RNA-HIF-1α轉(zhuǎn)入腎癌786-O細(xì)胞,與未轉(zhuǎn)染組相比,侵襲的細(xì)胞數(shù)為分別為43.7±1.2 v.s 48±1.6(3h);94±5.3 v.s 103±2.9(8h);148.7±12.4 v.s 146±12.9(12h);278.7±23.1 vs 300±23(24h),單因素方差分析結(jié)果為P=0.840.05,si RNA-HIF-1α對細(xì)胞侵襲能力無明顯影響。而將si RNA-HIF-2α轉(zhuǎn)入腎癌786-O細(xì)胞,與未轉(zhuǎn)染組相比,侵襲的細(xì)胞數(shù)為分別為43.7±1.2v.s 40±0.8(3h);94±5.3 v.s 56±4.8(8h);148.7±12.4 v.s 100±16.3(12h);278.7±23.1 v.s 183.3±47.1(24h)。單因素方差分析結(jié)果顯示P0.05,當(dāng)腎癌786-O細(xì)胞轉(zhuǎn)染si RNA-HIF-2α之后,缺氧條件下細(xì)胞侵襲能力不再出現(xiàn)增強(qiáng)的變化。由此推斷,缺氧誘導(dǎo)的腎癌786-O細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng),受HIF 2α調(diào)節(jié)。3.Western blotting檢測結(jié)果顯示:缺氧組和對照組相比,腎癌786-O細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)如下(缺氧v.s常氧):HIF2α0.73±0.066 v.s0.157±0.046;COX2 0.90±0.096 v.s 0.085±0.028;E-cadherin 0.233±0.102 v.s 0.727±0.069;Snail 0.817±0.073 v.s 0.097±0.022。與對照組比較,實(shí)驗(yàn)組(缺氧)細(xì)胞內(nèi)HIF2α、COX2表達(dá)升高,E-cadherin表達(dá)降低,Snail表達(dá)升高(P0.05);HIF2α與COX2表達(dá)水平呈正相關(guān)(P=0.0010.05,r=0.46),COX2與E-cadherin表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。(p=0.0000.05,r=-0.34)。Western blotting檢測轉(zhuǎn)染了si RNA-HIF-1α和si RNA-HIF-2α的腎癌786-O缺氧細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá),結(jié)果示(si RNA-HIF-1αv.s si RNA-HIF-2α):COX2 0.93±0.20 v.s 0.07±0.03;E-cadherin 0.05±0.02 v.s 0.75±0.10;Snail 1.11±0.28 v.s 0.19±0.05。單因素方差分析結(jié)果顯示,P=0.0000.05。與未轉(zhuǎn)染組相比較,抑制細(xì)胞內(nèi)HIF 2α的表達(dá)(轉(zhuǎn)染si RNA-HIF-2α),導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)COX2表達(dá)降低,E-cadherin表達(dá)升高,Snail表達(dá)降低,而抑制細(xì)胞內(nèi)HIF 1α后(轉(zhuǎn)染si RNA-HIF-1α),上述蛋白的表達(dá)無明顯變化。4.MTT比色法結(jié)果顯示,常氧條件下培養(yǎng)腎癌786-O細(xì)胞12小時(shí),NS398濃度不超過40u M,細(xì)胞的增殖活性(%)無明顯改變,89±11.6 v.s 96±7.2,P0.05,可見NS398濃度為40 u M,作用腎癌786-O細(xì)胞12小時(shí),對細(xì)胞無直接毒性作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)為排除NS398可能對腎癌786-O細(xì)胞的直接毒性作用,選擇40u M濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。5.Transwell檢測結(jié)果顯示:常氧組與常氧+NS398組比較,細(xì)胞侵襲結(jié)果為114.3±26.6 v.s 117.7±26.3,P0.05,常氧條件下,NS398對細(xì)胞侵襲能力無明顯影響;缺氧組與缺氧+NS398組比較:154±17.7v.s 110±26.9,P0.05,缺氧誘導(dǎo)腎癌786-O細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)(前面實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)),而NS398可以在缺氧條件下抑制腎癌786-O細(xì)胞增強(qiáng)的侵襲能力。由此可見,缺氧條件下,NS398逆轉(zhuǎn)了腎癌786-O侵襲能力的增強(qiáng)。Western blot檢測各種蛋白的表達(dá),HIF 2α在常氧組與常氧組+NS398組中的表達(dá)量為別為0.16±0.06 v.s 0.11±0.03,P0.05;HIF 2在α缺氧組與缺氧+NS398組中的表達(dá)量分別為0.73±0.06 v.s 0.73±0.03,P0.05;COX2在常氧組和常氧+NS398組的表達(dá)量分別為0.095±0.05 v.s 0.085±0.04,P0.05;COX2在缺氧和缺氧+NS398組中的表達(dá)量為別為0.9±0.14 v.s 0.18±0.12,P0.05。E-cadherin在常氧和常氧+NS398組中的表達(dá)量分別為0.73±0.10 v.s 0.78±0.12,P0.05;E-cadherin在缺氧和缺氧+NS398組中的表達(dá)量為別為0.23±0.14 v.s0.72±0.12,P0.05。Snail在常氧和常氧+NS398組中的表達(dá)量分別為0.10±0.03 v.s 0.09±0.05,P0.05;Snail在缺氧和缺氧+NS398組中的表達(dá)量為別為0.82±0.10 v.s 0.12±0.07,P0.05。由此可見,NS398降低了缺氧腎癌786-O細(xì)胞中的COX2的表達(dá),隨之出現(xiàn)了E-cadherin表達(dá)升高,Snail表達(dá)下降。結(jié)論:1.采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,成功將si-RNA-HIF 1α、si-RNA-HIF 2α腎癌786-O細(xì)胞內(nèi),并且能夠有效抑制其相應(yīng)的靶蛋白;2.轉(zhuǎn)染si-RNA-HIF 2α,腎癌786-O細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng),不再出現(xiàn)細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng),而轉(zhuǎn)染si-RNA-HIF 1α后,腎癌786-O細(xì)胞在缺氧條件下,其侵襲能力的增強(qiáng)無明顯變化。由此推斷,缺氧誘導(dǎo)的腎癌786-O細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng)受HIF 2α的調(diào)節(jié);3.雖然缺氧誘導(dǎo)了腎癌786-O細(xì)胞內(nèi)HIF 1α和HIF 2α升高,但是僅HIF 2α能夠?qū)е掳谢駽OX2蛋白表達(dá)升高,最終引起E-cadherin/Snail通路激活,導(dǎo)致細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng),而HIF 1α的表達(dá)升高并不能導(dǎo)致COX2及E-cadehrin/Snail通路的激活;4.COX2特異性抑制劑NS398,能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的COX2的表達(dá)升高,導(dǎo)致E-cadherin/Snail失活,使缺氧誘導(dǎo)的腎癌786-O細(xì)胞的侵襲能力的變化在缺氧環(huán)境中不再出現(xiàn)。第三部分腎癌組織中缺氧侵襲相關(guān)蛋白HIF2α、COX2以及E-cadherin/Snail的表達(dá)及意義目的:探討腎癌組織內(nèi)與缺氧侵襲相關(guān)蛋白HIF-2α、COX2、E-cadherin/Snail的表達(dá),分析這些蛋白表達(dá)之間的關(guān)系、蛋白的表達(dá)與腎癌患者的臨床分期、病理分級(jí)之間的關(guān)系。方法:收集2012年1月1日---2015年3月31手術(shù)切除的60例腎癌標(biāo)本,按照2004年WHO推薦的分期法對患者進(jìn)行臨床分期,按照1997年WHO推薦的病理分級(jí)方法,對患者標(biāo)本進(jìn)行病理分級(jí)。統(tǒng)計(jì)患者的年齡、性別、腫瘤大小、患者臨床分期和病理分級(jí);運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測標(biāo)本中HIF-2α、COX2、E-cadherin/Snail蛋白的表達(dá)并對蛋白進(jìn)行評分,統(tǒng)計(jì)各種蛋白表達(dá)量之間的關(guān)系、蛋白表達(dá)量與患者臨床分期和病理分級(jí)之間的關(guān)系。結(jié)果:1.本組病例共60人,術(shù)后病理診斷均為腎細(xì)胞癌。其中腎臟透明細(xì)胞癌30例,嫌色細(xì)胞癌5例,乳頭狀腺癌4例,集合管癌1例�；颊吣挲g最大者79歲,最小者26歲,男性29例,女性21例。超聲檢查腫瘤直徑(最長徑)最大者7.4cm,最小者1.8cm。臨床分期中,Ⅰ期15例,Ⅱ期25例,Ⅲ期16例,Ⅳ期4例。按照病理級(jí)別統(tǒng)計(jì)高分化者14例,中分化者27例,低分化者19例。2.在60例腎癌標(biāo)本組織中,所有標(biāo)本均行免疫組織化學(xué)檢測HIF-2α、COX2、E-鈣粘素以及Snail蛋白的表達(dá)。HIF 2α陽性表達(dá)47例(47/60),陰性表達(dá)11例(11/60);COX2陽性表達(dá)43例(43/60),陰性表達(dá)17例(17/60);E-ca陽性表達(dá)25例(25/60),陰性表達(dá)35例(35/60);Snail陽性表達(dá)50例(50/60),陰性表達(dá)10例(10/60)。3.腎癌組織中HIF 2α的表達(dá)與COX2的表達(dá)存在相關(guān)性。隨著HIF2α表達(dá)強(qiáng)度升高,腎癌組織中COX2的表達(dá)陽性率逐漸升高,其表達(dá)強(qiáng)度亦有所升高(P=0.0010.05,r=0.442)。4.HIF 2α的表達(dá)與腎癌臨床分期和病理分級(jí)之間存在正相關(guān)。隨著患者臨床分期升高,患者HIF 2α表達(dá)的陽性率越高。在高臨床分期的患者中,HIF 2α的表達(dá)強(qiáng)度越高(P=0.0000.05,r=0.439)。腎癌組織病理分級(jí)越高,越可能出現(xiàn)HIF 2α高表達(dá),其表達(dá)強(qiáng)度與病理分級(jí)顯著相關(guān)(P=0.0360.05,r=0.272)。5.腎癌組織中COX2的表達(dá)與Ecadherin的表達(dá)之間正相關(guān)。在COX2表達(dá)陽性的標(biāo)本中,E-cadherin的表達(dá)率顯著降低。隨著COX2表達(dá)強(qiáng)度升高,E-cadherin的表達(dá)強(qiáng)度有逐漸降低的趨勢,兩者呈負(fù)相關(guān)。(P=0.0000.05,r=-0.509)。6.隨著患者臨床分期越來越高,腎癌組織中COX2的表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度升高;同樣,在高分級(jí)的腎癌組織中,COX2的表達(dá)率上升,表達(dá)強(qiáng)度升高。腎癌組織COX2的表達(dá)與腎癌的臨床分期(P=0.0090.05,r=0.336)、病理分級(jí)之間存在正相關(guān)(P=0.0180.05,r=0.303)。7.腎癌組織中,E-鈣粘素的表達(dá)與腎癌的臨床分期無顯著相關(guān)(P=0.0730.05);但是E-鈣粘素的表達(dá)陽性率和表達(dá)強(qiáng)度與腎癌的病理分級(jí)存在負(fù)相關(guān),E鈣粘素的表達(dá)越低,患者的病理分級(jí)可能越高(P=0.0060.05,r=-0.352)。結(jié)論:1.腎癌組織中HIF2α的表達(dá)與COX2的表達(dá)呈正相關(guān),隨著HIF2α陽性表達(dá)率升高,COX2的陽性表達(dá)率亦升高;2.HIF2α的表達(dá)與腫瘤臨床分期和分級(jí)呈正相關(guān);3.腎癌組織中COX2的表達(dá)與E-鈣粘素(E-cadherin)之間呈正相關(guān);4.腎癌組織中COX2的表達(dá)與腫瘤的臨床分期和腫瘤病理分級(jí)之間呈正相關(guān);5.腎癌組織中E-cadherin的表達(dá)與腫瘤的臨床分期無關(guān),與腫瘤的病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。第四部分缺氧和NS398對腎癌786-O細(xì)胞中Sorafenib IC50的影響目的:探討缺氧和NS398對腎癌786-O細(xì)胞中Sorafenib IC50的影響。方法:1.將腎癌786-O細(xì)胞分8組,其中4組為實(shí)驗(yàn)組,于缺氧條件下培養(yǎng)。對照組于常氧條件下培養(yǎng)。Sorafenib按照2.5u M、5.0 u M、10.0u M、20.0 u M終濃度與腎癌細(xì)胞共培養(yǎng)12小時(shí),MTT比色法檢測細(xì)胞增殖情況,計(jì)算不同濃度缺氧和常氧組細(xì)胞的抑制率。2.將腎癌786-O細(xì)胞分成缺氧組、常氧組、缺氧+NS398組、常氧+NS398組,每個(gè)組按照Sorafenib不同濃度再次分成4個(gè)小組(2.5u M、5.0 u M、10.0 u M、20.0 u M),培養(yǎng)12小時(shí)。采用MTT檢測細(xì)胞增殖情況,計(jì)算各濃度下細(xì)胞的抑制率。根據(jù)公式細(xì)胞抑制率(%)=1-細(xì)胞活性(%),計(jì)算得出細(xì)胞抑制率。SPSS 19.0軟件中采用Probit回歸模型,分析常氧環(huán)境和缺氧環(huán)境中腎癌786-O細(xì)胞對sorafenib的IC50。結(jié)果:1.缺氧條件下培養(yǎng)的腎癌786-O細(xì)胞與常氧條件下的腎癌786-O細(xì)胞比較,在Sorafenib各濃度下,細(xì)胞活性為(缺氧vs常氧)96.6±3.4 vs 78.9±4.41(2.5 u M);85.4±2.6 vs 62.4±2.4(5.0 u M);63±1.9 vs 42.9±2.5(10.0 u M);41.7±2.3 vs 17.2±1.6(20.0 u M)。缺氧組細(xì)胞增殖較常氧組明顯升高P0.05;Sorafenib IC50分別為:缺氧v.s常氧17.8±2.4u M v.s 7.8±1.5u M。P0.05。2.當(dāng)腎癌細(xì)胞中加入COX2特異性抑制劑NS398(40u M),再次進(jìn)行Sorafenib抑制試驗(yàn),結(jié)果顯示:常氧組IC 50 7.25±2.17(u M);常氧組+NS398 IC50 7.38±2.73(u M);缺氧組IC50 15.01±3.19(u M);缺氧組+NS398 IC50 6.99±1.98(u M)。單因素方差分析結(jié)果顯示僅缺氧組IC50較其他三組明顯升高(P0.05),而常氧組、缺氧+NS398組、常氧+NS398組之間IC50無明顯差異。結(jié)論:1)缺氧條件培養(yǎng)的腎癌786-O細(xì)胞對Sorafenib反應(yīng)降低,細(xì)胞對藥物耐受性增加,IC50升高。2)在缺氧條件下,Srafenib聯(lián)合NS398與腎癌786-O細(xì)胞培養(yǎng),能夠有效降低缺氧誘導(dǎo)的Sorafenib IC50升高。第五部分Sorafenib聯(lián)合NS398治療缺氧裸鼠腎癌移植瘤的療效觀察目的:探討缺氧對裸鼠腎癌移植瘤體內(nèi)生長的影響以及缺氧對Sorafenib治療裸鼠腎癌移植瘤的效果的影響。方法:1.將60只6周齡雄性BALB/c裸鼠皮下注射腎癌786-O細(xì)胞,建立動(dòng)物腎癌移植瘤模型,檢測裸鼠的腫瘤大小。2.腫瘤體積達(dá)到40-50 mm3時(shí),按照每組10只隨機(jī)將動(dòng)物分成6組。3個(gè)組在缺氧條件下飼養(yǎng)并進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),另外3組在常氧下進(jìn)行對照試驗(yàn)。分別為缺氧、常氧、缺氧+Sorafenib、常氧+Sorafenib、缺氧+NS398+Sorafenib、常氧+NS398+Sorafenib,待裸鼠在缺氧環(huán)境下適應(yīng)3天后開始給藥并測量腫瘤的大小。給藥劑量按照Sorafenib 30mg/kg,NS398 3mg/kg進(jìn)行裸鼠灌胃,1次/日。對照組給予同樣容量的藥物溶劑。每2-3天測量裸鼠腫瘤的體積及體重。3.3周后處死小鼠,取出腫瘤,Western blotting檢測腫瘤內(nèi)HIF-2α、COX2、E-cadherin及Snail蛋白表達(dá)量,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1.缺氧組和常氧組比較,裸鼠體內(nèi)的腫瘤體積在給藥后第9天開始出現(xiàn)明顯變化,腫瘤體積(缺氧vs常氧,mm3)分別為:115.6±6.2 vs 109.5±8.1(9天);315.6±11.2 vs 228.5±7.2(12天);385.6±14.2 vs 346.6±12.6(15天);512.5±13.2 vs 459.6±12.3(18天);698.8±16.5 vs 626.3±16.2(21天),在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),缺氧組裸鼠腫瘤體積較常氧組裸鼠體積明顯增大(P0.05)。2.常氧組和常氧組+Sorafenib組比較,各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積(缺氧vs常氧,mm3)分別為:109.5±8.1 vs 89.9±6.2(9天);228.5±7.2 vs 164.2±7.1(12天);346.6±12.6 vs 219.3±11.2(15天);459.0±15.2 vs 289.2±11.6(18天);626.3±16.2 vs 426.9±14.2(21天),在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),靶向治療藥物Sorafenib治療組(常氧組+Sorafenib)較未行靶向治療的(常氧組)裸鼠體積明顯縮小。(P0.05)。3.缺氧+Sorafenib與常氧+Sorafenib及缺氧組比較,各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積(缺氧vs常氧,mm3)分別為:108.4±5.8 vs 89.9±6.2(9天);208.6±5.2 vs 164.2±7.1(12天);248.6±5.9 vs 219.3±11.2(15天);425.5±13.9 vs 289.2±11.6(18天);534.8±14.3 vs 426.9±14.2(21天)。在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),給予裸鼠靶向治療,缺氧組裸鼠腫瘤體積較常氧組裸鼠體積明顯增大(P0.05)。4.缺氧+NS398+Sorafenib與常氧+NS398+Sorafenib比較,各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積(缺氧vs常氧,mm3)分別為:91.6±4.8 vs 81.9±6.2(9天);162.6±9.1 vs 135.5±7.2(12天);178.2±3.1 vs 182.3±12.7(15天);236.5±9.2 vs 245.0±12.4(18天);315.8±11.2 vs 326.8±12.9(21天)兩組腫瘤體積無明顯變化(P0.05)。5.Western blotting檢測腫瘤組織中HIF2α、COX2、E-cadherin以及Snail蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示:在常氧組內(nèi),HIF2α、COX2、E-cadherin以及snail的表達(dá)無顯著差異;在缺氧組內(nèi),上述蛋白的表達(dá)亦無明顯差異。但是,缺氧組和常氧組之間,上述蛋白的表達(dá)存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為進(jìn)一步研究抗腫瘤治療過程中,腫瘤體積變化的原因。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn),COX2的表達(dá)量與腫瘤組織的體積存在相關(guān)性,r=0.972。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明COX2特異性抑制劑在抗腫瘤過程中能夠有效地增強(qiáng)Sorafenib的治療效果。結(jié)論:1.與常氧條件相比較,缺氧能夠促進(jìn)裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長;2.裸鼠體內(nèi)移植瘤生長的大小,與COX2的表達(dá)有關(guān);3.Sorafenib能夠有效抑制腫瘤的生長,但是缺氧可促使腫瘤對其反應(yīng)性降低;4.COX2特異性抑制劑能夠增強(qiáng)Sorafenib的抗腫瘤作用,逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的腫瘤耐藥。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.11

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1 溫恩懿;廖偉;趙聰敏;;NS398對缺氧缺血性腦損傷新生鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力的干預(yù)效應(yīng)[J];重慶醫(yī)學(xué);2009年22期

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本文編號(hào)：1890761