發(fā)布時(shí)間：2018-05-10 08:57

  本文選題：木犀草素 + 乳腺癌　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：[背景與目的]乳腺癌發(fā)病率逐年增高,機(jī)制仍欠清晰。木犀草素可抑制多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展,乳腺癌中報(bào)道少。抑癌基因失活是腫瘤發(fā)生重要機(jī)制,采用藥物逆轉(zhuǎn)是腫瘤防治重要策略。OPCML抑癌基因甲基化失活可致腫瘤發(fā)生、進(jìn)展。本研究旨在探討木犀草素對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的影響,對其中OPCML抑癌基因表達(dá)的影響,并探討其在細(xì)胞增殖、侵襲中的作用機(jī)制。[方法]1.體外培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系BT474,用不同濃度木犀草素孵育后,采用CCK-8、劃痕及Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察木犀草素對BT474細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力的影響;建立裸鼠異種移植瘤模型,觀察不同濃度木犀草素對移植瘤生長的影響。2.木犀草素處理BT474細(xì)胞或移植瘤裸鼠,實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測不同濃度木犀草素對BT474細(xì)胞及裸鼠異種移植瘤中OPCML mRNA和蛋白表達(dá)影響;采用siRNAOPCML轉(zhuǎn)染BT474細(xì)胞,觀察siRNA干擾前后能否影響木犀草素對BT474細(xì)胞的生長抑制作用;構(gòu)建OPCML表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染BT474細(xì)胞,觀察其能否影響細(xì)胞的生長增殖。3采用甲基化特異性PCR法檢測木犀草素處理前后OPCML啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平,同時(shí)測定木犀草素處理前后細(xì)胞內(nèi)甲基化及轉(zhuǎn)錄因子Sp1活性;qPCR、Western blot檢測木犀草素對DNMT1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響;轉(zhuǎn)染使BT474細(xì)胞過表達(dá)Sp1,觀察其對木犀草素處理后OPCML表達(dá)、啟動(dòng)子甲基化以及DNMT1 mRNA表達(dá)的影響;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測BT474細(xì)胞的凋亡情況以及細(xì)胞周期的變化,凋亡相關(guān)分子r-H2AX磷酸化情況,Caspase-8的活化以及cPARP的水平。[結(jié)果](1)采用不同濃度木犀草素處理BT474細(xì)胞后,可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移,呈一定的濃度與時(shí)間依賴性;同時(shí),木犀草素也可抑制裸鼠皮下腫瘤的形成和生長。(2)木犀草素可上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中、乳腺癌異種移植瘤中OPCML mRNA及蛋白的表達(dá);siRNA沉默OPCML后可減弱木犀草素對BT474細(xì)胞增殖、侵襲與遷移的抑制作用;此外,細(xì)胞內(nèi)OPCML過表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、侵襲、遷移;(3)木犀草素可抑制OPCML啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化;并能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)以及移植瘤中甲基化活性;木犀草素能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)以及移植瘤中DNMT1 mRNA及蛋白的表達(dá),木犀草素能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)SP1的活性;過表達(dá)Sp1,木犀草素對DNMT1的抑制作用、對DNA甲基化的抑制作用、對OPCML表達(dá)的誘導(dǎo)作用都減弱;木犀草素可誘導(dǎo)BT474細(xì)胞凋亡;誘導(dǎo)BT474細(xì)胞r-H2A磷酸化,促caspase-8活化,上調(diào)細(xì)胞內(nèi)cPARP水平。[結(jié)論]:木犀草素可通過抑制OPCML基因的啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化并上調(diào)其表達(dá)水平,從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡,抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。
[Abstract]:Background and objective: the incidence of breast cancer is increasing year by year and the mechanism is still unclear. Luteolin inhibits the occurrence and progression of multiple tumors, and is rarely reported in breast cancer. Inactivation of tumor suppressor gene is an important mechanism of tumorigenesis. Drug reversal is an important strategy for prevention and treatment of cancer. The methylation inactivation of OPCML suppressor gene can lead to tumorigenesis and progress. The purpose of this study was to investigate the effect of luteolin on the occurrence and development of breast cancer and the expression of OPCML tumor suppressor gene, and to explore the mechanism of luteolin in cell proliferation and invasion. [methods] 1. Breast cancer cell line BT474 was cultured in vitro. After incubation with luteolin of different concentrations, the effects of luteolin on the proliferation, migration and invasion of BT474 cells were observed by CCK-8, scratch and Transwell chamber experiments. To observe the effect of luteolin at different concentrations on the growth of transplanted tumor. The effects of luteolin on the expression of OPCML mRNA and protein in BT474 cells and xenografts of nude mice were detected by real-time quantitative PCR and Western blot. SiRNAOPCML was used to transfect BT474 cells. The effects of luteolin on the growth inhibition of BT474 cells were observed before and after siRNA interference, and the expression vector of OPCML was constructed and transfected into BT474 cells. The effect of luteolin on cell growth and proliferation was observed. Methylation specific PCR assay was used to detect the methylation level of OPCML promoter region before and after luteolin treatment. At the same time, the intracellular methylation and Sp1 activity of transcription factor Sp1 were measured before and after luteolin treatment. The effect of luteolin on the expression of DNMT1 mRNA and protein was detected by Western blot, and the expression of OPCML was observed after BT474 cells were overexpressed by transfection. The effects of promoter methylation and DNMT1 mRNA expression, apoptosis and cell cycle changes of BT474 cells, the activation of Caspase-8 and the level of cPARP were detected by flow cytometry. [results] after treated with luteolin at different concentrations, BT474 cells could significantly inhibit the proliferation, invasion and migration of breast cancer cells in a dose-dependent and time-dependent manner. Luteolin can also inhibit the formation and growth of subcutaneous tumor in nude mice. Luteolin can up-regulate the expression of OPCML mRNA and protein in breast cancer xenografts. After silencing OPCML, luteolin can attenuate the proliferation of BT474 cells by luteolin. In addition, overexpression of OPCML in cells inhibited cell proliferation, invasion and migration (3) luteolin inhibited DNA methylation in OPCML promoter region, and down-regulated methylation activity in cells and xenografts. Luteolin can down-regulate the expression of DNMT1 mRNA and protein in cells and transplanted tumors, luteolin can down-regulate the activity of SP1 in cells, over-express Sp1, inhibit DNMT1 and DNA methylation. Luteolin could induce apoptosis of BT474 cells, phosphorylation of r-H2A, activation of caspase-8 and up-regulation of cPARP in BT474 cells. [conclusion] luteolin can induce cell cycle arrest and apoptosis by inhibiting methylation and up-regulation of promoter region of OPCML gene, thus inhibiting proliferation, migration and invasion of breast cancer cells.
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：1868672