本文選題：miR-373 + 乳腺癌�。� 參考：《暨南大學》2017年博士論文

【摘要】：第一部分 miR-373介導的TRPS1下調促使乳腺癌侵襲轉移的分子機制及臨床意義研究背景:乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤,是癌癥導致女性死亡的最主要原因。盡管經(jīng)過長期深入研究,早期診斷和治療乳腺癌有了長足的進步,但是轉移率和術后復發(fā)率仍然很高。因此,闡明乳腺癌轉移復發(fā)的機制,發(fā)現(xiàn)新的預后標記物,具有重要的科學意義和臨床價值。乳腺癌的侵襲轉移是一個多步驟、多因素參與的復雜過程,許多癌基因、抑癌基因、轉移相關基因以及一些非編碼RNA參與了這個過程的調控。非編碼RNA miR-373的異常表達與乳腺癌的侵襲轉移密切相關,但miR-373在乳腺癌侵襲轉移的分子機制目前仍不清楚。我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)TRPS1可能是miR-373的一個新的候選靶標基因。目前,TRPS1主要集中在分化和發(fā)育方面的研究,TRPS1在乳腺癌中的生物學功能尚不明確,通過什么樣的作用機制影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展還不清楚。本論文在前期研究的基礎上,旨在探討miR-373調控候選靶標基因TPRS1在乳腺癌侵襲轉移中的功能、分子機制和臨床意義,為干預乳腺癌遠端轉移提供新的靶點線索。研究方法:1.分別沉默和過表達miR-373,Western Blotting檢測TRPS1的表達。2.生物信息學預測結合雙熒光報告基因、點突變等實驗驗證miR-373直接抑制TRPS1的表達。3.Western Blotting檢測不同轉移潛能的腫瘤細胞中TRPS1的表達。4.Transwell和Western Blotting檢測干擾和過表達TRPS1對腫瘤細胞的遷移侵襲能力以及EMT分子表型的變化。5.NOD-SCID小鼠尾靜脈注射TRPS1穩(wěn)定沉默表達細胞株檢測TRPS1對腫瘤轉移能力的影響。6.構建野生型和突變型的TRPS1載體,Western Blotting和Transwell檢測miR-373high的乳腺癌細胞中的TRPS1的表達、遷移侵襲能力的變化。7.同時沉默TRPS1和抑制miR-373的組合處理,Western Blotting和Transwell檢測TRPS1的表達、遷移侵襲能力的變化。8.SILAC定量蛋白質組學技術篩選受TRPS1調控的下游分子FOXA1。9.分別干擾和過表達TRPS1,q PCR和Western Blotting檢測FOXA1的表達。10.生物信息學預測結合雙熒光報告基因、點突變、Ch IP-q PCR等實驗驗證TRPS1轉錄激活FOXA1的表達。11.同時沉默TRPS1和過表達FOXA1的組合處理,Transwell和Western Blotting檢測乳腺癌細胞的遷移侵襲能力以及EMT分子表型的變化。12.在臨床樣品數(shù)據(jù)分析中確認TRPS1與FOXA1之間的病理學相關性。深入分析TRPS1水平的高低與病理學指標和生存期之間的關系。研究結果:1.TRPS1是miR-373的直接靶標基因,miR-373通過結合TRPS1的3’UTR區(qū)下調TRPS1的表達。2.TRPS1在高轉移潛能的腫瘤細胞中下調,TRPS1的下調促進了乳腺癌EMT和侵襲轉移。3.在動物水平證實穩(wěn)定沉默TRPS1促進乳腺癌的遠處轉移。4.TRPS1是miR-373促使乳腺癌EMT和侵襲轉移的主要靶標基因。5.TRPS1作為轉錄激活因子,直接結合FOXA1的啟動子區(qū)促進FOXA1的轉錄。6.TRPS1通過上調EMT負調控因子FOXA1的表達,從而抑制乳腺癌的侵襲轉移和EMT。7.臨床樣品中TRPS1與FOXA1的表達存在正相關關系。8.TRPS1低表達的乳腺癌病人預后較差,提示了TRPS1低表達可以作為乳腺癌預后差的一個指標。結論:本論文首次發(fā)現(xiàn)了TRPS1作為轉錄激活因子,激活EMT負調控因子FOXA1的轉錄。闡明miR-373介導了TRPS1在乳腺癌中的低表達,下調FOXA1的表達,最終促進乳腺癌的EMT和侵襲轉移的分子機制。第二部分miR-373-TXNIP-HIF1α-TWIST-miR-373信號反饋環(huán)在乳腺癌侵襲轉移的作用及機理研究研究背景:我們前期工作證實了,miR-373通過結合抑癌基因TXNIP的3’UTR區(qū)下調TXNIP的表達,從而促進乳腺癌EMT和遷移侵襲。本論文是在前期研究的基礎上,進一步探討miR-373如何通過TXNIP促使乳腺癌侵襲轉移的功能機制,以及miR-373下調的TXNIP促使乳腺癌侵襲轉移的分子機制和臨床意義。研究方法:1.NOD-SCID小鼠尾靜脈分別注射miR-373、miR-373/TXNIP-3’UTR和miR-373/TXNIP穩(wěn)定表達細胞株,檢測腫瘤的肺轉移能力。2.分別過表達miR-373或沉默TXNIP,同時加入1μM濃度的氧化劑H2O2處理12h,Transwell檢測乳腺癌細胞的遷移侵襲能力的變化。3.分別抑制miR-373或過表達TXNIP,同時加入2m M濃度的抗氧化劑NAC處理24h,Transwell檢測乳腺癌細胞的遷移侵襲能力的變化。4.分別沉默和過表達HIF1α,Western Blotting檢測TWIST的表達。5.同時過表達TXNIP和miR-373的組合處理,Western Blotting和IF檢測HIF1α和TWIST的表達、核定位行為的變化。6.分別沉默和過表達HIF1α或TWIST,q PCR檢測miR-373的表達。7.同時沉默TWIST和過表達HIF1α的組合處理,q PCR檢測miR-373的表達。8.生物信息學預測結合雙熒光報告基因、點突變、Ch IP-q PCR等實驗驗證TWIST轉錄激活miR-373的表達。9.在臨床樣品數(shù)據(jù)分析miR-373-TXNIP-HIF1α-TWIST-miR-373信號反饋環(huán)的臨床意義。研究結果:1.在前期研究成果的基礎上,我們進一步在動物水平證實miR-373通過靶向抑制TXNIP促進乳腺癌的遠處轉移。2.miR-373介導的TXNIP的沉默,引起細胞內的ROS水平下調,促進了乳腺癌的侵襲轉移。3.由miR-373過表達和TXNIP沉默介導的ROS水平下調,促進了HIF1α及其下游TWIST的移位入核和表達上調。4.HIF1α及其下游TWIST存在對miR-373的正反饋調節(jié),TWIST通過結合miR-373的啟動子區(qū)促進miR-373的轉錄。5.闡明miR-373-TXNIP-HIF1α-TWIST-miR-373信號反饋環(huán)介導了乳腺癌EMT和侵襲轉移。這一調控機制與乳腺癌病人的預后差顯著相關,提示了此信號反饋環(huán)的激活可作為乳腺癌病人預后差的一項診斷指標。結論:本論文在前期研究的基礎上,闡明了由miR-373激活的miR-373-TXNIP-HIF1α-TWIST-miR-373信號反饋環(huán)促使乳腺癌EMT和侵襲轉移的分子機制,證實了該信號反饋環(huán)的激活可作為乳腺癌的預后標志物。
[Abstract]:Part 1: the molecular mechanism and clinical significance of miR-373 mediated TRPS1 downregulation in breast cancer invasion and metastasis: breast cancer is the most common female malignant tumor, and is the most important cause of cancer leading to female death. Although long - term in-depth study, the early diagnosis and treatment of breast cancer have made considerable progress, but the transfer rate The recurrence rate is still very high. Therefore, it is of great scientific significance and clinical value to elucidate the mechanism of metastatic recurrence of breast cancer and discover new prognostic markers. The invasion and metastasis of breast cancer is a multistep, complex process involving multiple factors, many oncogenes, tumor suppressor genes, metastasis related genes and some non coded RNA. The abnormal expression of non coding RNA miR-373 is closely related to the invasion and metastasis of breast cancer, but the molecular mechanism of miR-373 in the invasion and metastasis of breast cancer is still unclear. We found that TRPS1 may be a new candidate target gene for miR-373 in earlier work. At present, TRPS1 is mainly concentrated in the differentiation and development side. The biological function of TRPS1 in breast cancer is not clear. What kind of mechanism of action affects the development of the tumor is not clear. On the basis of previous studies, this paper aims to explore the function, molecular mechanism and clinical significance of the miR-373 regulation candidate target gene TPRS1 in the invasion and metastasis of breast cancer, in order to intervene in mammary gland. Distal metastasis of cancer provides new target clues. Study methods: 1. silence and overexpression of miR-373, Western Blotting detection of TRPS1 expression,.2. bioinformatics prediction combined with double fluorescent reporter gene, point mutation and other experiments verify that miR-373 directly inhibits TRPS1 expression by.3.Western Blotting to detect TRPS1 in tumor cells with different metastatic potential. Expression of.4.Transwell and Western Blotting detection of interference and overexpression of TRPS1 to tumor cell migration and invasion and changes in the phenotype of EMT molecule.5.NOD-SCID mouse tail vein injection TRPS1 stable silent expression cell lines detection of TRPS1 on tumor metastasis ability,.6. construction of wild type and mutant TRPS1 vector, Western Blotti Ng and Transwell detection of the expression of TRPS1 in breast cancer cells of miR-373high, changes in migration and invasion ability.7. simultaneously silence TRPS1 and combination of inhibition of miR-373, Western Blotting and Transwell detection TRPS1 expression, migration and invasion ability change.8.SILAC quantitative proteomics technology screening downstream molecules regulated by downstream molecules 1.9. interference and overexpression of TRPS1, Q PCR and Western Blotting detection of FOXA1,.10. bioinformatics prediction combined with double fluorescent reporter gene, point mutation, Ch IP-q PCR, etc. Changes in cell migration and invasion and changes in EMT molecular phenotype.12. confirm the pathological correlation between TRPS1 and FOXA1 in clinical sample data analysis. The relationship between the level of TRPS1 and the pathological indexes and life period is analyzed. The results of the study: 1.TRPS1 is the direct target gene of miR-373, miR-373 by combining TRPS1's 3 'UTR. The expression of TRPS1 is down regulated in the tumor cells with high metastatic potential. The down regulation of TRPS1 promotes the EMT and invasion and metastasis of the breast cancer EMT and the metastasis.3. in the animal level, which is stable and silent TRPS1 to promote the distant metastasis of breast cancer..4.TRPS1 is the main target gene of miR-373 to promote breast cancer EMT and invasion and metastasis.5.TRPS1 as a transcription activator. Directly combining the promoter region of FOXA1 to promote the transcriptional.6.TRPS1 of FOXA1 by up regulation of the expression of EMT negative regulator FOXA1, thus inhibiting the invasion and metastasis of breast cancer and the expression of TRPS1 and FOXA1 in the EMT.7. clinical samples, the prognosis of breast cancer patients with low expression of positive correlation.8.TRPS1 is poor, suggesting that the low expression of TRPS1 can be used as mammary gland. Conclusion: TRPS1 is first discovered as a transcription activator and activates the transcription of EMT negative regulator FOXA1. MiR-373 mediates the low expression of TRPS1 in breast cancer, down regulation of FOXA1 expression, and ultimately promotes the molecular mechanism of EMT and invasion and metastasis of breast cancer. Second part miR-373-TXNIP-HIF1 alpha -TWIS The research background of the role and mechanism of T-miR-373 signal feedback loop in the invasion and metastasis of breast cancer: our previous work has confirmed that miR-373 reduces the expression of TXNIP by combining the 3 'UTR region of the tumor suppressor gene TXNIP, thus promoting the EMT and migration of breast cancer. This paper is based on the earlier research, and further explores how miR-373 passes through TX. The molecular mechanism and clinical significance of NIP to promote invasion and metastasis of breast cancer and the molecular mechanism and clinical significance of miR-373 down-regulation of TXNIP to promote invasion and metastasis of breast cancer. Research methods: miR-373, miR-373/TXNIP-3 'UTR and miR-373/TXNIP in 1.NOD-SCID mice were injected respectively with miR-373, miR-373/TXNIP-3' UTR and miR-373/TXNIP, and the lung metastasis of the tumor was detected by.2. over expression of miR. -373 or TXNIP, while adding 1 micron M concentration of oxidant H2O2 to 12h, Transwell to detect the migration and invasion of breast cancer cells,.3. inhibits miR-373 or overexpression TXNIP respectively. The expression of HIF1 alpha and Western Blotting in the detection of TWIST expression.5. and the combination of TXNIP and miR-373. Western Blotting and IF detect the expression of HIF1 alpha and TWIST. CR detection of miR-373 expression.8. bioinformatics prediction combined with double fluorescent reporter gene, point mutation, Ch IP-q PCR and other experiments to verify the clinical significance of TWIST transcriptional activation miR-373 expression.9. in the clinical sample data analysis miR-373-TXNIP-HIF1 alpha -TWIST-miR-373 signal feedback loop. Study fruit: 1. on the basis of previous research results, we entered One step at animal level shows that miR-373 promotes the distant metastasis of.2.miR-373 mediated TXNIP silencing through target inhibition of TXNIP, causing the ROS level down regulation in cells, promoting the invasion and metastasis of breast cancer,.3., miR-373 overexpression and TXNIP silencing mediated ROS downregulation, promoting HIF1 A and its downstream TWIST translocation and translocation. The expression of.4.HIF1 alpha and its downstream TWIST are positive feedback regulation of miR-373, and TWIST promotes miR-373 transcriptional.5. by combining the promoter region of miR-373 to clarify that miR-373-TXNIP-HIF1 a -TWIST-miR-373 signal feedback loop mediates breast cancer EMT and invasion and metastasis. This regulation mechanism is significantly related to the poor prognosis of breast cancer patients. The activation of this signal feedback loop can be used as a diagnostic indicator of poor prognosis in breast cancer patients. Conclusion: on the basis of previous studies, this paper elucidates the molecular mechanism of miR-373 activated miR-373-TXNIP-HIF1 alpha -TWIST-miR-373 signal feedback loop for breast cancer EMT and invasion and metastasis, and confirms that the activation of the signal feedback loop can be used as a result. Prognostic markers for breast cancer.

【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：1803592