本文選題：OX40 + CD47��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：腫瘤免疫治療是目前單克隆抗體的一個主要發(fā)展方向。以PD1-PDL1通路為代表的免疫檢查點抗體在臨床上的巨大成功使更多的與免疫細胞激活相關(guān)靶點的抗體藥物的研發(fā)成為熱點。其中,OX40、CD47兩個免疫系統(tǒng)相關(guān)分子,被逐步驗證可以作為有效的治療性抗體靶點。OX40(又稱CD134、TNFRSF4、ACT35)是表達于活化的CD4+T、CD8+T細胞表面的激活性受體。OX40信號可以激活下游的NF-κB、PI3K和PKB通路,這些通路的持續(xù)激活最終能夠延長T細胞的存活,促進T細胞的增殖。OX40廣泛表達于慢性炎癥及腫瘤部位的T細胞上。其配體OX40L能夠促進B細胞的活化及抗體產(chǎn)生。兩者能在活化的T細胞和B細胞之間進行雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo),具有強大的生物學(xué)功能。因此,研發(fā)抗OX40抗體對腫瘤治療具有重要的現(xiàn)實意義。CD47(又稱整聯(lián)蛋白、卵巢癌標志物)是表達于多種腫瘤細胞表面并作用于巨噬細胞及DC細胞的免疫檢查點分子,通過與巨噬細胞表面的SIRPα結(jié)合向其傳遞“Don′t eat me”信號,實現(xiàn)免疫逃逸。阻斷CD47-SIRPα通路可以促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬,同時還可以提高腫瘤特異性抗原的免疫遞呈,激活特異性T細胞對腫瘤細胞的殺傷,達到同時激活固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答的效果。本課題主要圍繞免疫抗腫瘤抗體藥物的發(fā)現(xiàn)和評價,一方面嘗試利用大容量抗體庫篩選技術(shù)獲得抗OX40激動型抗體,為腫瘤的免疫治療提供新的候選分子;另一方面針對已經(jīng)獲得的一株抗CD47功能抗體,探索其與其它靶向抗體聯(lián)合抗腫瘤的應(yīng)用。本課題的第一部分是圍繞免疫抗腫瘤抗體藥物的發(fā)現(xiàn),以T細胞表面共刺激分子OX40為靶點,篩選抗OX40單抗并進行初步鑒定。依托已構(gòu)建的大容量全合成全人源噬菌體單鏈抗體庫平臺,以O(shè)X40為抗原進行多輪多次的固相篩選。經(jīng)過3輪條件漸進嚴苛的篩選后,得到8株陽性克隆,其中一株得到極好的富集;所有陽性克隆通過基因工程改造成全抗體形式,形成重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒按照一定的比例轉(zhuǎn)染HEK293-F細胞進行全抗體的瞬時表達;并基于AKTA系統(tǒng)對全抗體進行純化。之后分別通過以下方法驗證了全抗體的特性。第一,通過ELISA驗證了全抗體與抗原OX40在分子水平上的結(jié)合活性;第二,通過間接免疫熒光驗證了全抗體與細胞表面抗原的結(jié)合活性;第三,通過流式細胞術(shù)驗證了全抗體與細胞表面抗原的結(jié)合活性和特異性;第四,采用ELISA方法測定了全抗體的特異性;第五,通過血清放置實驗驗證了全抗體的血清穩(wěn)定性;第六,通過BIAcore TM3000初步測定了全抗體親和力。實驗結(jié)果顯示,通過3輪噬菌體單鏈抗體庫固相篩選后,得到8株陽性單鏈抗體,scFv-1在篩選過程中富集率達到了95%;8株中有5株順利改造成全抗體并表達純化。對各抗體分子的特性進行探究發(fā)現(xiàn),OX40mab-4、OX40mab-8與抗原的結(jié)合活性較差,OX40mab-5、OX40mab-6的特異性較差,因此這4株抗體在鑒定過程中被逐漸淘汰。相比于其他4株抗體,OX40mab-1具有較好的結(jié)合活性,與OX40結(jié)合的EC50為0.015μM,特異性、血清穩(wěn)定性也較好,親和力為251 nM。因此確定OX40mab-1作為后續(xù)研究的候選抗體分子。本課題的第二部分是圍繞免疫抗腫瘤抗體藥物的評價,以本室已獲得的一株高親和力全人源抗CD47特異性抗體AMMS4-G4為研究對象,探究該抗體在腫瘤模型體內(nèi)聯(lián)合其他靶向抗體的藥效。該抗體可以阻斷CD47-SIRPα的結(jié)合,并且能夠有效促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用。體內(nèi)試驗已證實該抗體獨立給藥時,能夠顯著延長白血病模型小鼠的生存期,有效清除模型動物體內(nèi)的白血病細胞;因此,本課題基于以上研究背景,探究了AMMS4-G4在腫瘤小鼠模型中聯(lián)合其他靶向抗體聯(lián)合用藥的藥效,期望能夠探索出此抗體在腫瘤應(yīng)用中的新方法,為臨床治療奠定基礎(chǔ)。本課題選擇了三種聯(lián)合靶向抗體:A2C1、Herceptin和Rituximab。A2C1是本室獲得的另一株靶向人EGFR的阻斷型抗體,正在開展針對人結(jié)直腸癌的臨床試驗;Herceptin是一株靶向人HER2的人源化單抗,臨床上主要用于治療HER2陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌;Rituximab是一株靶向人CD20的人鼠嵌合單抗,臨床上主要用于治療CD20陽性的非霍奇金淋巴瘤�；贏MMS4-G4和上述三種靶向抗體的特性,本課題構(gòu)建了以下腫瘤動物模型。分別是同時表達人CD47和EGFR的人結(jié)腸癌細胞Lovo荷瘤裸鼠模型;同時表達人CD47和HER2的人卵巢癌細胞Skov3荷瘤裸鼠模型;同時表達人CD47和CD20的淋巴瘤Raji腫瘤模型,分別用于考察AMMS4-G4和A2C1、Herceptin和Rituximab聯(lián)合用藥的治療效果�？笴D47治療性抗體聯(lián)合用藥藥效評價主要從以下幾個方面展開。第一,通過流式細胞術(shù)檢測了抗體與腫瘤細胞表面相關(guān)抗原的結(jié)合;第二,小鼠接種腫瘤細胞、分組、建立荷瘤小鼠模型;第三,建模成功的荷瘤小鼠模型分組給藥、測量腫瘤體積、觀察臨床癥狀;第四,根據(jù)腫瘤生長情況,停止給藥并繼續(xù)觀察,對小鼠實施安樂死,對腫瘤重量進行統(tǒng)計學(xué)分析,并評價聯(lián)合用藥藥效結(jié)果。第五,初步探究荷瘤小鼠模型聯(lián)合用藥的藥效學(xué)機制。實驗結(jié)果顯示,在Lovo荷瘤裸鼠模型上,低劑量(即12.5 mg/kg)A2C1、AMMS4-G4聯(lián)合給藥時相比A2C1、AMMS4-G4任一抗體單獨給藥腫瘤重量明顯下降,腫瘤體積明顯減小,說明聯(lián)合用藥具有更好的藥效;同時,高劑量(即25 mg/kg)A2C1、AMMS4-G4聯(lián)合給藥組雖然與A2C1單給藥組統(tǒng)計學(xué)差異不明顯,但仍可見有更好的抑瘤趨勢。對A2C1、AMMS4-G4的聯(lián)合用藥機制進行探究發(fā)現(xiàn),抗EGFR抗體A2C1有可能協(xié)同抗CD47抗體AMMS4-G4下調(diào)Lovo腫瘤組織中CD47的含量;同時研究還發(fā)現(xiàn),AMMS4-G4可能具有與A2C1同樣的腫瘤組織內(nèi)蓄積作用。在Skov3荷瘤模型中,雖然Herceptin、AMMS4-G4聯(lián)合給藥相比Herceptin、AMMS4-G4任一抗體單獨給藥藥效并無顯著改善,但從趨勢上講聯(lián)合用藥仍具有一定優(yōu)勢,而且研究還發(fā)現(xiàn)AMMS4-G4單用時藥效顯著好于對照抗體huIgG,與商業(yè)化抗體Herceptin藥效相當。同樣在Raji荷瘤模型中,AMMS4-G4單用時藥效良好,且能夠顯著抑制腫瘤細胞向骨髓轉(zhuǎn)移。綜上所述,本課題在抗腫瘤單抗藥物的發(fā)現(xiàn)和評價方面做了兩方面工作,第一,篩選靶向T細胞表面的共刺激分子OX40的單克隆抗體。通過3輪篩選后得到一株與抗原結(jié)合活性較好,特異性、血清穩(wěn)定性較好,親和力為251 nM的抗OX40單抗分子,為腫瘤免疫治療提供新的候選分子。第二,針對已經(jīng)獲得的一株抗CD47功能抗體AMMS4-G4,探索其與其他靶向抗體聯(lián)合用藥時在腫瘤動物模型上的藥效,體內(nèi)試驗顯示,在Lovo荷瘤模型中A2C1聯(lián)合AMMS4-G4同時給藥相比任一抗體單獨給藥都具有更好的藥效,其藥效機制有可能是A2C1協(xié)同AMMS4-G4下調(diào)Lovo腫瘤組織中CD47的含量。而在Skov3、Raji荷瘤模型中,AMMS4-G4單用時藥效良好。這為AMMS4-G4在抗腫瘤免疫治療方面提供了用藥指導(dǎo)。
[Abstract]:Anti - OX40 ( CD47 - SIRSF4 , ACT 35 ) is an active receptor for the treatment of tumor cells . This study was conducted to investigate the effect of AMMS4 - G4 on tumor cells . The second part of this study was to investigate the effect of AMMS4 - G4 on tumor cells . The results showed that the effect of AMMS4 - G4 on tumor animal model was better than that of A2C1 and AMMS4 - G4 . The results showed that AMMS4 - G4 had better effect compared with that of A2C1 and AMMS4 - G4 . The effect mechanism of AMMS4 - G4 has been proved to be good when AMMS4 - G4 is used alone in the treatment of anti - tumor immunotherapy .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5
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本文編號：1788494