本文選題：磷酸腺苷激活的蛋白激酶 + C6神經(jīng)酰胺　； 參考：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景和目的傳統(tǒng)腫瘤化療藥(如長春新堿)使用存在嚴(yán)重局限,腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)腫瘤化療藥存在先天或獲得性耐藥,這是由于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平或活性的改變,以及影響藥物的活性和/或代謝的蛋白的影響�；熢雒舻鞍滓恢笔前┌Y研究的一大焦點(diǎn)。許多研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的短鏈細(xì)胞滲透性神經(jīng)酰胺(C6)的活性,以增加現(xiàn)有的化療藥物的抗腫瘤活性。C6神經(jīng)酰胺顯著提高的多個(gè)抗癌藥物的活性,包括紫杉醇、阿霉素和組蛋白去乙�；敢种苿�(HDACi)。但這個(gè)增敏的分子機(jī)制仍然是不明確。長春新堿是一種常用的抗癌化療藥物。它是一種細(xì)胞周期特異性的藥物,結(jié)合于微管蛋白,抑制微管結(jié)構(gòu)的組裝和阻止有絲分裂的中期,使癌細(xì)胞不能發(fā)生有絲分裂。它已被廣泛地應(yīng)用于各種類型的化療方案用于治療患者腫瘤,在不同的癌癥中其有效率變化大,使用后癌細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出耐藥的趨勢(shì)發(fā)展。長春新堿誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的分子機(jī)制仍然不清楚。我們以前的研究已經(jīng)表明,激活A(yù)MP活化蛋白激酶(AMPK)可能是介導(dǎo)長春新堿活性的關(guān)鍵信號(hào)。我們團(tuán)隊(duì)一直注重AMPK對(duì)癌細(xì)胞的抑制能力。持續(xù)激活A(yù)MPK示通過調(diào)節(jié)多個(gè)下游信號(hào)的目標(biāo)來誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡和生長抑制,包括在活化的mTOR復(fù)合體1(mTORC1)、磷酸化的p53、激活自噬,等等。這里我們顯示,在多個(gè)人類癌細(xì)胞系中,無論是在體內(nèi)和體外,C6神經(jīng)酰胺顯著地提高了長春新堿誘導(dǎo)的抗癌活性。在分子水平上,我們發(fā)現(xiàn)AMPK依賴性p53活化可能是介導(dǎo)的敏化效應(yīng)關(guān)鍵的信號(hào)。研究方法和材料人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞,人胰腺癌PANC-1細(xì)胞和人卵巢癌A2780細(xì)胞中,所有細(xì)胞均從上海生命科學(xué)研究院(上海,中國)購買,并維持在RPMI/DMEM培養(yǎng)基中(Sigma公司,圣路易斯,密蘇里州),加入10%的FBS(Sigma公司,圣路易斯,密蘇里州),青霉素/鏈霉素(1:100,Sigma),培養(yǎng)在37℃CO 2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞給予指定的c6神經(jīng)酰胺和或長春新堿處理,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),運(yùn)用mtt方法檢測(cè)細(xì)胞存活率,同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,計(jì)算活細(xì)胞率;運(yùn)用組蛋白dna-elisa及annexinv試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡,ldh分析法檢測(cè)細(xì)胞死亡率,線粒體免疫共沉淀分離線粒體,通過jc-10染料測(cè)定細(xì)胞線粒體膜電位(mmp),westernblot檢測(cè)總的和磷酸化的ampkα、acc、p53、cyp-d、bcl-2、hif-1α、s6k1等信號(hào)通路的改變;運(yùn)用程序性死亡抑制劑及凋亡抑制劑進(jìn)一步驗(yàn)證c6神經(jīng)酰胺和長春新堿誘導(dǎo)細(xì)胞死亡方式。建立cyp-d-shrna、p53-shrna、ampkα1-shrna及ampk-α1顯性失活(dn)突變(dn-ampk-α1)cdna穩(wěn)轉(zhuǎn)的腫瘤細(xì)胞,運(yùn)用上述方法進(jìn)一步驗(yàn)證信號(hào)通路的改變。制備脂質(zhì)體c6神經(jīng)酰胺,運(yùn)用上述方法驗(yàn)證其體外活性,建立裸鼠模型,予以分組靜脈給藥,記錄裸鼠存活率,腫瘤大小,免疫組化檢測(cè)組織ampkα表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證脂質(zhì)體c6神經(jīng)酰胺增強(qiáng)長春新堿的抗腫瘤機(jī)制。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中,至少使用三個(gè)孔/平皿。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少三次,每次獲得具有相似的結(jié)果。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)。使用spss15.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),通過one-wayanova,scheffe和tukey檢驗(yàn)。p0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試劑的濃度和治療持續(xù)時(shí)間基于發(fā)表文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。研究結(jié)果1、c6神經(jīng)酰胺在多個(gè)人腫瘤細(xì)胞系顯著提高了長春新堿誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性。長春新堿單獨(dú)只有適度抑制hct-116結(jié)腸癌細(xì)胞存活,與c6神經(jīng)酰胺共同用藥顯著增加長春新堿的活性,從而導(dǎo)致細(xì)胞活力大幅降低。c6神經(jīng)酰胺的效果是劑量依賴性的,2.5-10.0μg/ml的c6能夠顯著增加長春新堿的活性,而c6神經(jīng)酰胺本身對(duì)hct-116細(xì)胞的存活率幾乎沒有影響。c6神經(jīng)酰胺和長春新堿聯(lián)合給藥導(dǎo)致了大量的細(xì)胞死亡,并且聯(lián)合效果比任一單獨(dú)藥劑顯著高。另外兩個(gè)人癌細(xì)胞系a2780卵巢癌細(xì)胞和panc-1胰腺腫瘤細(xì)胞,同樣觀察到協(xié)同作用。2、c6神經(jīng)酰胺促進(jìn)長春新堿誘導(dǎo)的凋亡和程序性壞死。使用組蛋白dna的elisa測(cè)定法和膜聯(lián)蛋白vfacs測(cè)定法進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè),結(jié)果表明,長春新堿(1μm)單獨(dú)用藥僅誘導(dǎo)極少的hct-116細(xì)胞凋亡,而與c6神經(jīng)酰胺(10μg/ml)共用藥顯著增強(qiáng)效果。c6神經(jīng)酰胺對(duì)細(xì)胞凋亡的增敏作用幾乎被廣譜caspase抑制劑z-vad-fmk抑制。通過ldh釋放的增加檢測(cè)長春新堿誘導(dǎo)的hct-116細(xì)胞程序性壞死,c6神經(jīng)酰胺的共同用藥處理明顯增加細(xì)胞程序性壞死,而壞死抑制劑necrostatin-1(nec-1)抑制了聯(lián)合用藥的效果。重要的是,z-vad-fmk或nec-1單獨(dú)可部分抑制c6神經(jīng)酰胺加長春新堿誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性,但兩者聯(lián)合可幾乎阻斷。需要注意的是nec-1比z-vad-fmk減輕細(xì)胞毒性更有效。類似的結(jié)果在a2780卵巢癌細(xì)胞和panc-1胰腺癌細(xì)胞中也見到。3、c6神經(jīng)酰胺和長春新堿協(xié)同激活ampk依賴性的mtorc1的抑制以及細(xì)胞凋亡和程序性壞死。westernblot的結(jié)果表明,在hct-116細(xì)胞和a2780細(xì)胞中,c6神經(jīng)酰胺和長春新堿協(xié)同活化ampk通道,比任一藥物單獨(dú)使用更有效。通過磷酸化s6k1(thr-389)的檢測(cè)反應(yīng)mtorc1活化的,并且對(duì)mtorc1依賴性基因,包括bcl-2和hif-1α的表達(dá)的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)共同用藥后比單藥mtorc1相關(guān)蛋白水平顯著下調(diào)。類似的結(jié)果在a2780細(xì)胞中也見到。在共同給藥刺激的腫瘤細(xì)胞中,無論是ampk的激活抑制,還是由基因沉默(shrna敲低表達(dá))或通過引入顯性失活(dn)的突變,都可恢復(fù)s6k1磷酸化和bcl-2/hif-1α的表達(dá)。重要的是,在hct-116細(xì)胞中,c6神經(jīng)酰胺加長春新堿引起的細(xì)胞活力下降,細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死都被ampk沉默或失活突變所抑制。4、c6神經(jīng)酰胺和長春新堿協(xié)同誘導(dǎo)ampk依賴的p53激活,使其易位到線粒體,與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mptp)相關(guān)蛋白親環(huán)素d(cyp-d)絡(luò)合形成復(fù)合物。c6神經(jīng)酰胺或長春新堿單獨(dú)誘導(dǎo)hct-116細(xì)胞中度p53的活化(磷酸化和上調(diào))。兩者聯(lián)合用藥引起p53的活化進(jìn)一步增加,抑制ampk(shrna沉默或基因突變)抑制p53活化。westernblot檢測(cè)線粒體蛋白質(zhì)表明c6神經(jīng)酰胺加長春新堿導(dǎo)致p53的轉(zhuǎn)位到線粒體,p53和磷酸化p53兩者都前往線粒體。此外,線粒體-ip實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,p53的易位與cyp-d的形成復(fù)合物,這個(gè)復(fù)合物被ampk或cyp-d的沉默所抑制。另外,westernblot檢測(cè)表明通過共同給藥后p53基因易位被ampk沉默抑制,但不被cyp-d沉默抑制。反之,ampk激活aicar誘導(dǎo)p53的激活,導(dǎo)致p53線粒體易位,以及與cyp-d結(jié)合。通過jc-10染料檢測(cè)刺激后hct-116細(xì)胞中的mmp,結(jié)果表明,c6神經(jīng)酰胺和長春新堿協(xié)同降低mmp,比單獨(dú)給藥更有效。通過相對(duì)應(yīng)的shrna沉默ampk或cyp-d抑制聯(lián)合用藥所誘導(dǎo)的mmp減少。5、線粒體蛋白質(zhì)cyp-d需要的c6神經(jīng)酰胺和長春新堿聯(lián)合給藥引起壞死,但不是凋亡。Cyp-D抑制劑環(huán)孢菌素A(CSA)以及shRNA敲低Cyp-D幾乎阻斷聯(lián)合用藥誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死,而留下的細(xì)胞凋亡不受影響。C6神經(jīng)酰胺加長春新堿誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低被Cyp-D-抑制減少。通過的shRNA沉默p53不僅抑制聯(lián)合用藥誘導(dǎo)的壞死,而且還抑制了細(xì)胞凋亡。6、脂質(zhì)體的C6神經(jīng)酰胺在體外和體內(nèi)高效增敏長春新堿的活性。根據(jù)以前的操作規(guī)程成功合成了脂質(zhì)體C6神經(jīng)酰胺。體外研究結(jié)果表明,該脂質(zhì)體C6神經(jīng)酰胺增強(qiáng)長春新堿誘導(dǎo)的HCT-116細(xì)胞和A2780細(xì)胞活力降低和凋亡,并且比非脂質(zhì)體的C6神經(jīng)酰胺具有更高的效率。在體內(nèi),脂質(zhì)體C6神經(jīng)酰胺加長春新堿聯(lián)合對(duì)小鼠模型給藥,發(fā)現(xiàn)HCT-116或A2780異種移植生長受到顯著抑制。脂質(zhì)體的C6神經(jīng)酰胺或長春新堿作為單一給藥,發(fā)現(xiàn)HCT-116或A2780在體內(nèi)生長的只略微受到抑制。IHC檢測(cè)結(jié)果表明,在腫瘤異種移植模型中脂質(zhì)體的C6神經(jīng)酰胺和長春新堿聯(lián)合給藥(48小時(shí))也可誘導(dǎo)顯著AMPK磷酸化/活化,并與非脂質(zhì)體的C6神經(jīng)酰胺的結(jié)果相一致。小鼠體重也不受上述藥物使用的影響。結(jié)論1、C6神經(jīng)酰胺大幅增敏長春新堿誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和程序性壞死。2、C6神經(jīng)酰胺和長春新堿協(xié)同激活A(yù)MPK-P53,調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和程序性壞死。3、聯(lián)合用藥后AMPK的活化導(dǎo)致mTOR抑制和Bcl-2/HIF-1α的降解。4、聯(lián)合用藥后AMPK依賴性的p53與Cyp-D-線粒體結(jié)合介導(dǎo)程序性壞死。5、在體外和體內(nèi)脂質(zhì)體C6神經(jīng)酰胺敏化長春新堿誘導(dǎo)的活性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.5

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